宋江涛，郭卫春

(武汉大学 人民医院 骨科，湖北 武汉 430060)

黄芩素在诱导骨肉瘤细胞株U2-OS凋亡过程中对Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响

宋江涛，郭卫春*

(武汉大学 人民医院 骨科，湖北 武汉 430060)

目的研究黄芩素在诱导骨肉瘤细胞株U2-OS凋亡信号转导过程中对凋亡相关基因Bcl-2、Bax的影响。方法采用RT-PCR检测黄芩素作用前、后骨肉瘤细胞株U2-OS中Bcl-2和Bax的mRNA表达变化情况，了解不同的黄芩素剂量和作用时间骨肉瘤细胞株U2-OS中凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达变化，并计算Bcl-2/Bax比值。结果与骨肉瘤组相比，黄芩素作用组Bcl-2的mRNA表达随着浓度增加和作用时间延长而递减，Bax的mRNA表达随着浓度增加和作用时间延长而递增，Bcl-2/Bax比值下降。结论黄芩素能通过下调Bcl-2的mRNA表达和上调Bax的mRNA表达而诱导骨肉瘤细胞凋亡。

黄芩素；Bcl-2；Bax；凋亡；骨肉瘤

黄芩素是从唇形科植物黄芩中提取的主要活性成分之一，是一种有潜在应用价值的抗癌新药。目前有研究表明黄芩素可抑制肺癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞增殖并诱导凋亡[1-2]。但对其抗肿瘤机制的研究尚不深入，尤其对骨肉瘤的作用和相关机制研究甚少。已有研究证实黄芩素对骨肉瘤U2-OS细胞株有生长抑制作用，且促进U2-OS细胞凋亡[3]。本实验以不同浓度黄芩素处理骨肉瘤U2-OS细胞，采用RT-PCR检测黄芩素作用骨肉瘤细胞前、后细胞中Bcl-2和Bax表达的变化情况，探讨Bcl-2和Bax是否参与黄芩素诱导骨肉瘤细胞凋亡的信号通路。

1 材料

骨肉瘤细胞株U2-OS(上海中科院生物细胞库)；DMEM高糖型培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；胰蛋白酶冻干粉(不含EDTA)(美国Sigma公司)；黄芩素(中国食品药品检定研究院)，将其溶于二甲基亚砜(DMSO)中制备成400 μmol·L-1的母液，培养基稀释成工作浓度(用培养基稀释后工作液DMSO浓度<0.1%)，-20 ℃储存。

2 方法

2.1 细胞培养

U2-OS细胞贴壁生长于含10%胎牛血清的DMEM高糖型培养液中，其中青、链霉素各100 U·mL-1，于37 ℃、5% CO2的饱和湿度孵育箱中培养。做细胞生长曲线，对数生长期处于细胞传代后第3～5天，取对数生长期细胞进行实验。药物浓度组用5个同底面积培养瓶培养细胞，待细胞生长至铺满培养瓶底面积90%以上终止培养，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，分别加入用培养基稀释药物黄芩素25、50、100、200 μmol·L-1，以培养基作空白对照，分别作用24 h后终止培养；作用时间组用5个同底面积培养瓶培养细胞，待细胞生长至铺满培养瓶底面积90%以上终止培养，PBS洗涤2次后，加入用培养基稀释药物黄芩素50 μmol·L-1分别作用24、48、72 h终止培养，以培养基作空白对照。

2.2 总RNA提取和RT-PCR

将每1×107个细胞加1 mL的Trizol，三氯甲烷-异戊醇(24∶1)，异丙醇，抽提总RNA，70%的乙醇水溶液洗涤，RNA沉淀用DEPCRo溶解，紫外分光光度计测RNA含量。经M-MLV逆转录酶系统合成cDNA后PCR扩增。同时扩增β-actin为内参照，引物设计如下：bcl-2引物，上游5′-TTCGCCGAG-ATGTCCAGGC-3′，下游5′-TCACTTGTGGCCCAGAT-AGG-3′，扩增片段387 bp。bax引物，上游5′-GAT-GCGTCCACCAAGAAG-3′，下游5′-GATCAGTTCC-GGCACCTT-3′，扩增片段243 bp。内参β-actin引 物：上游5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增片段540 bp。PCR反应按以下条件进行：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃ 1.5 min，其中后3步循环28次。反应结束后取反应液(5～10 μL)进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙啶染色，确认反应产物。

3 结果

3.1 药物浓度组中Bcl-2和Bax的表达情况

药物浓度组显示相同的作用时间随着药物浓度的增加，Bcl-2和Bax显现出明显的差异，顺浓度梯度增大Bcl-2表达减弱、Bax表达增强，见图1。

图1 不同浓度黄芩素培养24 h对U2-OS细胞Bcl-2和Bax表达的影响

3.2 作用时间组中Bcl-2和Bax的表达情况

作用时间组显示相同药物浓度随着作用时间的延长，Bcl-2表达递减、Bax表达递增，见图2。

图2 不同时间点25 μmol·L-1黄芩素对U2-OS细胞Bcl-2和Bax表达的影响

3.3 药物浓度组和作用时间组中Bcl-2/Bax的变化情况

在药物浓度组中，随黄芩素药物浓度增加，Bcl-2/Bax降低，见图3。在作用时间组中，随作用时间延长，Bcl-2/Bax降低，见图4。

图3 不同浓度黄芩素对U2-OS细胞Bcl-2和Bax表达的影响

图4 不同时间对U2-OS细胞Bcl-2和Bax表达的影响

4 讨论

细胞凋亡是生物体为调节机体发育、维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡的过程。细胞凋亡参与生物体中许多病理生理过程[4]，肿瘤的发生与发展是细胞增殖失控及凋亡抑制的结果。研究表明黄芩素具有抑制大多数肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用[5]。而这种作用可能是通过调控细胞凋亡相关基因进行的。

Bcl-2基因家族是重要的凋亡调节基因，其中Bax基因促进凋亡，Bcl-2基因抑制凋亡，Bcl-2家族成员通过相互竞争形成同型或异型二聚体，调控线粒体膜通透性从而双向调节细胞凋亡[6]。因此Bcl-2/Bax的比值对细胞的存活起着重要作用。Bax与Bcl-2在细胞中的比例决定细胞是否发生凋亡。Bax过量时，形成Bax-Bax同二聚体，诱导细胞凋亡；Bcl-2过量时，形成Bcl-2-Bax异二聚体，抑制细胞凋亡[7]。以往的实验表明黄芩素对骨肉瘤U2-OS细胞株有生长抑制作用，且促进U2-OS细胞凋亡。本实验证实，黄芩素可以在体外以剂量依赖和时间依赖方式诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。同时，我们发现Bcl-2、Bax在U2-OS未加药组都有表达，且Bcl-2表达比bax较强；加入不同浓度黄芩素作用24 h后，随着药物浓度增加Bcl-2表达逐渐降低、Bax表达量逐渐增高；用50 μmol·L-1的黄芩素分别作用24、48、72 h，随着作用时间增加Bcl-2的表达逐渐降低，Bax的表达量逐渐增高。可知，Bcl-2和Bax这两个凋亡调控基因参加了黄芩素诱导骨肉瘤细胞U2-OS凋亡信号传导通路。在不同药物浓度组和不同作用时间组，bcl-2/bax随药物浓度的增加和作用时间的延长均降低，这可能促进了骨肉瘤细胞U2-OS的凋亡。

本研究证实黄芩素在一定范围内以剂量和时间依赖性的方式诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。这种凋亡可能是受到抑制凋亡基因bcl-2表达下调和促进凋亡基因bax表达上调的调节，为其应用于骨肉瘤的临床治疗提供了一定的依据。

[1] Leung H W，Yang W H，Lai M Y，et al.Inhibition of 12-lipoxygenase during baicalein-induced human lung nons-mall carcinoma H460 cell apoptosis[J].Food Chem Toxicol，2007，45(3)：403-411.

[2] Ding X Z，Kuszynski C A，El-Metwally T H，et al.Lipoxygenase inhibition induced apoptosis，morphological changes，and carbonic anhydrase expression in human pancreatic cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，1999，266(2)：392-399.

[3] 陈会明，尹军强，罗文敏，等.黄芩素体外抗骨肉瘤作用的实验研究[J].时珍国医国药，2011，22(2)：303-304.

[4] Mnygoats K R，Yazzie M，Stearns D M.Ultrastruetural damage in chromium pieolinate-treated cells：a TEM study[J].J Biol Inorg Chem，2002，7(7/8)：791-798.

[5] 任学群.李宜雄.黄芩素抗肿瘤机制研究进展[J].河南大学学报(医学版) ，2010，29(3)：175-179.

[6] Ferlini C，Raspaglio G.Mozzetti S，et al.Bcl 2 down-regulation is a novel mechanism of paclitaxel resistance[J].Mol-Pharma-col，2003，64(1)：51-58.

[7] 弓清梅，李建强，刘卓拉.人鼠急性肺损伤过程中STAT3的活化对Bcl-2和Bax表达及细胞凋亡的影响[J].中国药物与临床，2007，7(1)：35-37.

EffectofBaicalein-inducedApoptosisonExpressionofBcl-2andBaxinU2-OSCells

SONGJiangtao，GUOWeichun*

(DepartmentofOrthopedics，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China)

Objective：To investigate the expression change of apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax in the induction of osteosarcoma cell line U2-OS apoptotic signal transduction with the effect of baicalein.MethodsRT-PCR was used to determine the mRNA expression of apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax，preand post administration of baicalein with different doses and length of time．ResultsCompared with the group of osteosarcoma，the expression of Bcl-2 was in inverse proportion to the concentration of baicaleinand its acting time，while the expression of Bax was in direct proportion to them．ConclusionBaicalein could induce the apoptosis of osteosarcoma cell line U2-OS via down-regulating of the expression of Bcl-2 and up-regulating of the expression of Bax．

Cerulenin；Bcl-2；Bax；apoptosis；osteosarcoma

2015-09-07)

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郭卫春，教授，博士生导师，研究方向：脊柱外科与骨肿瘤的基础与临床研究；E-mail：guoweichun@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.007