潘　琼，任　凯，崇殿龙，张智瑞，周　灿，刘　浩，赵素容



·基础医学·

3-溴丙酮酸对肝癌Bel7402细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

潘琼，任凯，崇殿龙，张智瑞，周灿，刘浩，赵素容

目的：观察糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸对肝癌Bel7402细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法：采用MTT法检测3-溴丙酮酸对Bel7402细胞的增殖抑制效应，PI单染流式细胞术检测不同浓度3-溴丙酮酸(0、50、100、200 μmol/L)对Bel7402细胞凋亡的影响，ATP检测试剂盒分析细胞内ATP水平，Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：3-溴丙酮酸可浓度和时间依赖性地抑制Bel7402细胞的增殖(P<0.01)，作用24、48、72 h的IC50值分别为422.9、143.9、85.0 μmol/L。3-溴丙酮酸可诱导Bel7402细胞发生明显的细胞凋亡，50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸作用24 h的细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.01)。ATP水平检测结果表明，3-溴丙酮酸可明显降低Bel7402细胞内的ATP水平(P<0.01)。Western blot结果显示，3-溴丙酮酸可下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，并上调凋亡诱导蛋白Bax的表达。结论：3-溴丙酮酸具有诱导肝癌Bel7402细胞凋亡的作用，其机制可能是通过引起细胞内ATP降低、调节细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。

肝脏肿瘤；3-溴丙酮酸；细胞凋亡

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高。我国是全球肝癌发病率和病死率最高的国家，肝癌患者约占全球的55%。手术治疗是肝癌的首选治疗方式，然而，许多患者由于远处转移、肝功能不全、健康状况差等原因而无法手术切除，使药物治疗在降低肿瘤复发、转移以及延长患者带瘤生存期等方面起着十分重要的作用。研究[1-4]发现，糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸对肝癌、鼻咽癌、乳腺癌等显示了良好的抗肿瘤效应，对肿瘤细胞有高度的选择性，且能杀伤耐药的肿瘤细胞，其作为抗肿瘤新药的研究引起了广泛关注。本实验研究3-溴丙酮酸对肝癌Bel7402细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂DMEM培养基、胰蛋白酶购自Gibco公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技公司，3-溴丙酮酸、MTT、PI购自Sigma公司，Bcl-2、Bax、β-actin抗体购自Santa Cruz公司，HRP标记的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG购自博士德生物工程公司，ATP检测试剂盒购自碧云天公司。

1.2细胞株肝癌细胞株Bel7402由中山大学惠赠。培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，置37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中常规培养。

1.3MTT比色法检测细胞增殖取对数生长期的Bel7402细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔8×103个细胞。培养过夜待细胞充分贴壁后换液加入不同浓度的3-溴丙酮酸(25、50、100、200、400 μmol/L)，另设溶剂对照组和空白对照组，每组设3个复孔，培养24、48、72 h后每孔加入15 μL MTT溶液继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，振荡使结晶物充分溶解，用酶标仪测定570 nm波长下的吸光度值(A570 nm)，计算细胞的存活率。细胞存活率(%) =(处理组A570 nm-空白组A570 nm)/(对照组A570 nm-空白组A570 nm)×100%。

1.4PI单染流式细胞术检测细胞凋亡将Bel7402细胞接种于12孔细胞培养板中，每孔2×105个细胞，待细胞贴壁后换液加入不同浓度的3-溴丙酮酸(50、100、200 μmol/L)处理细胞，同时设溶剂对照组，每组3个复孔。培养48 h后胰酶消化收集细胞，PBS洗1次，加预冷的75%乙醇于4 ℃或-20 ℃固定过夜。检测前用PBS洗2次，将细胞重悬于含PI(50 μg/mL)和RNase A(100 μg/mL)的PBS中，室温避光孵育30 min，上机检测具sub-G0/G1期DNA含量的细胞比例。

1.5细胞内 ATP水平检测将Bel7402细胞接种于12孔细胞培养板中，每孔2×105个细胞，培养24 h后换液加入终浓度为50、100、200 μmol/L的3-溴丙酮酸处理细胞，同时设溶剂对照组，每组3个复孔。处理4 h后收集细胞。采用ATP检测试剂盒，根据说明书进行操作，以酶标仪测定化学发光强度值。用实验组的化学发光强度值与对照组的化学发光强度值的比值确定各组的细胞内ATP水平。

1.6Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达将Bel7402细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔5×105个细胞，培养至90%汇合后，换液加入终浓度为50、100、200 μmol/L的3-溴丙酮酸处理细胞。培养24 h后收集细胞，每孔加入50 μL预冷的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。每组取40～50 μg蛋白进行12% SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜，室温封闭2～3 h，一抗4 ℃过夜或室温孵育2～3 h，TBST 洗膜3次，相应二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜3次，化学发光增强试剂盒显影，Bio-Rad 凝胶成像仪对膜进行曝光获取图像。

1.7统计学方法采用方差分析和q检验。

2　结果

2.13-溴丙酮酸对肝癌Bel7402细胞增殖的影响MTT检测结果表明，3-溴丙酮酸在25～400 μmol/L浓度范围内对Bel7402细胞的增殖具有明显的抑制作用(P<0.01)，且具有时间和浓度依赖性，作用24、48、72 h的IC50值分别为422.9、143.9、85.0 μmol/L(见表1)。

q检验：与对照组比较**P<0.01；与50 μmol/L比较△P<0.05，△△P<0.01；与100 μmol/L比较#P<0.05，##P<0.01

2.23-溴丙酮酸诱导肝癌细胞凋亡的作用结果表明，与相应对照组比较，50、100、200 μmol/L的3-溴丙酮酸可诱导Bel7402细胞发生显著的细胞凋亡(P<0.01)，并随着3-溴丙酮酸浓度增加，其细胞凋亡率亦显著增高(P<0.01)(见表2、图1)。

q检验：与对照组比较**P<0.01；与50 μmol/L比较△△P<0.01；与100 μmol/L比较##P<0.01

2.33-溴丙酮酸对Bel7402细胞内ATP水平的影响3-溴丙酮酸能特异性抑制糖酵解过程的限速酶己糖激酶Ⅱ的活性，使细胞因ATP供应不足而死亡[5]。与相应对照组比较，50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸作用4 h均可明显降低Bel7402细胞内的ATP水平(P<0.01)，并随着3-溴丙酮酸浓度增加，Bel7402细胞内的ATP水平显著降低(见表3)。

表3　3-溴丙酮酸对Bel7402细胞内ATP水平的影响

q检验：与对照组比较**P<0.01；与50 μmol/L比较△△P<0.01；与100 μmol/L比较##P<0.01

2.43-溴丙酮酸对Bel7402细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响结果表明，3-溴丙酮酸可下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，同时上调凋亡诱导蛋白Bax的表达(见图2)。

3　讨论

正常细胞主要通过氧化磷酸化过程提供能量，而多数肿瘤细胞即使在有氧条件下也仍以糖酵解作为主要的产能方式，这一现象被称为Warburg效应。由于糖酵解过程产生的能量比经由氧化磷酸化产生的能量少得多，是一种非常低效的产能方式，故保持高水平的糖酵解活性对肿瘤细胞的存活和生长十分重要。因此靶向有氧糖酵解而选择性杀伤肿瘤细胞的抗肿瘤策略具有广泛的临床开发和应用前景[6-7]。己糖激酶，特别是己糖激酶Ⅱ在维持肿瘤细胞高糖酵解活性方面发挥着关键作用。3-溴丙酮酸可抑制己糖激酶Ⅱ的活性，引起细胞内ATP耗竭而导致肿瘤细胞死亡，而对依赖氧化磷酸化供能的正常细胞几乎无毒性作用，其抗肿瘤作用近年来受到了广泛关注[8]。本实验结果显示，3-溴丙酮酸可明显降低Bel7402细胞内的ATP水平，导致细胞因能量供应不足而死亡。

Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的重要调控因子，包括凋亡抑制蛋白和凋亡诱导蛋白，前者主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL等，后者主要为Bax、Bak、Bad等[9]。凋亡抑制蛋白保护线粒体膜的完整性，而凋亡诱导蛋白促使凋亡因子如细胞色素C、细胞凋亡诱导因子、第二线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂等的释放，最终通过激活caspase激酶而导致细胞凋亡[10]。本实验中观察到，50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸处理Bel7402细胞24 h，可下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，而上调凋亡诱导蛋白Bax的表达，从而使线粒体膜的通透性增加以及凋亡因子的释放增多而诱导细胞凋亡。

本实验观察了3-溴丙酮酸对肝癌Bel7402细胞增殖及凋亡的影响，结果表明，3-溴丙酮酸对Bel7402细胞的增殖具有显著的抑制作用，并能诱导细胞凋亡。其促凋亡作用可能与药物引起细胞内ATP降低、调节细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达相关。

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[2]CARDACI S,DESIDERI E,CIRIOLO MR.Targeting aerobic glycolysis:3-bromopyruvate as a promising anticancer drug[J].J Bioenerg Biomembr,2012,44(1):17.

[3]YU SJ,YOON JH,YANG JI,etal.Enhancement of hexokinase Ⅱ inhibitor-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells via augmenting ER stress and anti-angiogenesis by protein disulfide isomerase inhibition[J].J Bioenerg Biomembr,2012,44(1):101.

[4]LIU XH,ZHENG XF,WANG YL.Inhibitive effect of 3-bromopyruvic acid on human breast cancer MCF-7 cells involves cell cycle arrest and apoptotic induction[J].Chin Med J(Engl),2009,122(14):1681.

[5]CHEN Z,ZHANG H,LU W,etal.Role of mitochondria-associated hexokinase Ⅱ in cancer cell death induced by 3-bromopyruvate[J].Biochim Biophys Acta,2009,1787(5):553.

[6]PAN JG,MAK TW.Metabolic targeting as an anticancer strategy:dawn of a new era? [J].Sci S Stke,2007(381):pe14.

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[8]SHOSHAN MC.3-Bromopyruvate:targets and outcomes[J].J Bioenerg Biomembr,2012,44(1):7.

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[10]GREEN DR.Apoptotic pathways:ten minutes to dead[J].Cell,2005，121(5):671.

(本文编辑刘梦楠)

Effects of 3-bromopyruvate on apoptosis and the expression of apoptosis-related proteins in liver carcinoma Bel7402 cells

PAN Qiong,REN Kai,CHONG Dian-long,ZHANG Zhi-rui,ZHOU Can,LIU Hao,ZHAO Su-rong

(FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege,AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,BengbuAnhui233030,China)

Objective:To investigate the effect of 3-bromopyruvate on the apoptosis of liver carcinoma cells,and its underlying mechanisms.Methods:The proliferative inhibition of Bel7402 cells treated with 3-bromopyruvate was measured by MTT assay.The cells were treated with different concentrations of 3-bromopyruvate( 0,50,100,200 μmol/L ),and apoptosis was analyzed by flow cytometry with PI staining.The intracellular ATP level was detected by commercial kit.The expression of Bcl-2 and Bax protein was analyzed by Western blot.Results:3-bromopyruvate inhibited the proliferation of Bel7402 cells in a time and concentration dependent manner,with an IC50value of 422.9,143.9,85.0 μmol/L at 24,48 and 72 h,respectively.3-Bromopyruvate also induced obvious apoptosis in Bel7402 cells.The apoptotic rate of 50,100,200 μmol/L of 3-bromopyruvate treatment for 24 h was significantly different from that of the control group(P<0.01).At the same time,3-bromopyruvate significantly decreased the intracellular ATP level(P<0.01).The result of Western blot showed that 3-bromopyruvate down-regulated the expression of antiapoptotic protein Bcl-2,and up-regulated the expression of proapoptotic protein Bax in Bel7402 cells.Conclusions:3-bromopyruvate can induce apoptosis in Bel7402 cells,which may be correlated to the inadequate ATP supply,down-regulation of Bcl-2,and up-regulation of Bax.

liver neoplasms;3-bromopyruvate;apoptosis

2015-08-20

国家自然科学基金项目(81372899)；安徽省高校自然科学研究重大项目(KJ2016A486)；安徽省大学生创新创业训练项目(201510367035)；蚌埠医学院科研基金项目(BYKY1408ZD)

单位] 蚌埠医学院 药学系，安徽省生化药物工程技术研究中心，安徽 蚌埠 233030

[作者简介] 潘琼(1991-)，女，2010级本科生，2015级硕士研究生.

赵素容，博士，硕士研究生导师，副教授.E-mail：inwindangel@qq.com

1000-2200(2016)09-1129-04

R 735.7

ADOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.09.003