郭泰春，雷新明，李飞云，王国英，史高峰

（兰州理工大学，甘肃　兰州　730050）

甘草次酸对自由基清除作用的电化学研究

郭泰春，雷新明，李飞云，王国英，史高峰

（兰州理工大学，甘肃兰州730050）

研究了应用电化学分析方法测定甘草次酸对自由基的清除作用。用石墨烯修饰玻碳电极，建立了一种应用石墨烯修饰玻碳电极的电化学方法测定甘草次酸及其对·OH（羟基），O2·-（超氧），ROOH（脂质过氧）自由基的清除作用。实验结果表明：甘草次酸的检出限为2.24×10-3g/L，相对标准偏差RSD为8.94%（n=5）。同时，甘草次酸对3种自由基均具有清除作用，清除能力大小为：O2·-＞ROOH＞·OH，清除率与浓度呈良好的线性关系。该方法具有易于操作、灵敏度好、检出限低以及价格低廉等优点。

甘草次酸；自由基；石墨烯；修饰电极；清除能力；线性关系

在正常的人体生理代谢过程中，人体本身的防御体系可以保持体内氧自由基的平衡［1～3］，但在机体产生病变、紫外线照射、化学毒物及药物影响、电离辐射等，此时自由基的平衡体系受到破坏［4］，从而引发机体自由基稳衡态紊乱，产生多余自由基，进而引发心脏病、动脉粥样硬化、癌症等严重疾病并加速衰老过程［5～7］。由于化学合成的抗氧化剂存在致癌、毒副作用等安全问题，因而，天然抗氧化剂是减轻细胞氧化损伤、预防相关疾病等最有效措施［8，9］。而甘草次酸是目前较有代表意义的抗衰老中药活性成分，具有抗心律失常和抗缺氧、抗炎、抗免疫、抗肿瘤和抗氧化等作用。

石墨烯是一种新型碳材料，其碳原子紧密堆积成单层二维蜂窝状晶格结构，具有高比表面和优异的电化学性能，高化学物理稳定性以及生物相容性等性质，被用于超灵敏传感器和电化学传感器等领域［12～13］。

自由基的检测方法有：邻苯三酚自氧化法、化学发光测定、荧光分光光度法、电子自旋共振技术与自旋捕捉法、气相色谱法等已有报道。这些检测体系重现性差，仪器复杂，操作繁琐，分析时间长［14］。因此本文用石墨烯修饰玻碳电极检测甘草次酸对自由基的清除作用的研究未见文献报道，该方法具有操作简单、灵敏度高、成本低廉等优点。

1　实验部分

1.1实验材料与仪器

所有实验均在CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）中进行，采用三电极系统，其中玻碳电极（Φ=3mm）作为工作电极，甘汞电极为辅助电极，铂片电极为对电极。电热蒸馏水器（北京科伟永兴仪器有限公司），超声波清洗器（KQ5200DE，北京科伟永兴仪器有限公司）。微量移液器（上海求精生化试剂仪器有限公司）。铁氰化钾（天津市光复科技发展有限公司），甘草酸单铵盐（实验室自制），石墨烯悬浮液（实验室自制），氧化铝粉末（0.05μm，美国GaossUnion公司）。

1.2电极处理

玻碳电极先后在1500#，2000#金相砂纸上打磨，完后用蒸馏水清洗电极表面。接着在麂皮上撒上少量Al2O3，然后滴加少量的蒸馏水，用玻碳电极上绝缘的部分稍微搅匀。直到电极表面呈镜面，在铁氰化钾溶液中扫描循环伏安曲线。氧化还原峰电位之差ΔEp在80mV以下，电极方可使用。本实验所测ΔEp=79mV。然后在打磨好的电极上滴加一定量的石墨烯悬浮液，在通风处风干数小时后待用。

1.3甘草次酸制备

称量12g甘草酸单铵盐，溶于100mL8%的硫酸溶液中，100℃下反应12h，得到7.5g灰白色甘草次酸粗品，水洗直至pH不再变化，50℃下干燥后，溶于氯仿中，煮沸10min，趁热过滤，浓缩，50℃下干燥。将以上甘草次酸粗品溶于80%的乙醇溶液中，80℃下保温，待悬浮物基本溶解，冰水浴析出沉淀，过滤，干燥，得到0.8g含量为91.59%（HPLC）精制甘草次酸。

1.4自由基的配制

羟基自由基（·OH）：称取0.3g七水硫酸亚铁晶体，定容至100mL容量瓶中，标为A液。精确称取0.05g30%的双氧水，定容至50mL容量瓶中，标为B液。A、B液均在0～4℃下保存备用。

脂质过氧自由基（ROOH）：：称取0.3g卵磷脂溶于30mL磷酸盐缓冲溶液（G，50mm/mol，pH7.4）中，冰水浴2h，标为C液。取0.01g氯化铁，定容至50mL容量瓶中，0.01g抗坏血酸，定容至50mL容量瓶中，分别标记为D、E液，0～4℃下保存备用。

超氧自由基（O2·-）：称取0.01g核黄素，用70%甲醇溶解定容至10mL容量瓶中，标为F液。称取0.02g甲硫氨酸，定容至50mL容量瓶中标为H液。0～4℃下保存备用。

1.5自由基清除实验

自由基产生体系和产生条件见表1，分别设置对照组和实验组。反应原理如下：

羟基自由基（·OH）：双氧水与亚铁离子反应生成·OH，即H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+，由于·OH活性高［15］，存活时间太短，用仪器很难检测到，因此在反应体系中加入抗氧化剂（捕捉剂）能有效捕捉· OH，起到一定的清除作用。

脂质过氧自由基（ROOH）：Fe3+与抗坏血酸诱导脂质体过氧化，即ROOH+Fe3+→ROO·+H++Fe2+。

超氧自由基（O2·-）：参照Beauchamp的光化学方法［16］，即在还原剂甲硫氨酸存在下，核黄素分子吸收一个光子被还原，在O2条件下，自氧化产生O2·-。

表1　自由基反应体系

2　结果与讨论

2.1甘草次酸的电化学行为

在50mmol/LPBS（磷酸盐缓冲溶液pH7.4），扫描速率为100mV/s，电势范围为-0.4～0.8V，富集时间为30s的条件下，加入一定量的甘草次酸溶液，记录氧化峰电流和氧化峰电位。如图1所示为修饰电极和裸电极分别测定甘草次酸的线性扫描伏安行为。结果表明：甘草次酸在裸玻碳电极上（图1a）出现了1个弱的氧化峰，Epa为0.33V，而在相同缓冲液和测定条件下样品在石墨烯修饰玻碳电极上（图1b）的氧化峰电流明显增大，说明石墨烯修饰玻碳电极对甘草次酸产生了电催化氧化作用。

图1　甘草次酸在裸玻碳电极（a），修饰电极（b）上的线性扫描伏安图

2.2线性范围、检出限

在上述缓冲溶液和测定条件下，用石墨烯修饰电极测定了不同浓度的甘草次酸的线性扫描伏安行为，浓度范围为0.016-0.08g/L。如图2所示（上）表示不同浓度下甘草次酸的电化学行为，由图可知随着浓度的不断增加，甘草次酸的峰电流不断增加，在浓度为0.016-0.08g/L（a-f）的范围内呈良好的线性范围，如图2（下）所示，线性回归方程为：Ip（μA）=2c（g/L）+6.08，R2=0.995，检出限为2.24×10-3g/L，相对标准偏差RSD为8.94%（n=5）。见表2为甘草次酸的含量测定结果与加样回收率。

图2　（上）表示不同浓度下甘草次酸的线性扫描伏安曲线，（下）表示甘草次酸浓度与峰电流的线性关系

表2　甘草次酸样品的测定结果

2.3甘草次酸对自由基的清除作用

甘草次酸对·OH，O2·-，ROOH自由基的清除效果，对照组和实验组线性扫描伏安曲线如图3所示，在甘草次酸的出峰位置Ep=0.33V处实验组峰电流小于对照组峰电流，说明实验组的一部分甘草次酸用于清除自由基，证明甘草次酸对自由基具有清除作用。其清除效果见表3。由表3数据可知，甘草次酸对3种自由基的清除效果为O2·-＞ROOH＞· OH。清除率计算公式如下：

图3　甘草次酸对自由基清除作用的线性扫描伏安曲线，b表示对照组，a表示实验组

配制2、4、6、8、10ug/mL的甘草次酸样品，测定其对自由基清除效果的线性伏安行为。图4为甘草次酸对自由基清除率与浓度的关系，由图可知甘草次酸对O2·-自由基的清除能力最强，对ROOH和· OH的清除能力次之。

图4　甘草次酸对3种自由基的清除作用与浓度关系

表3　甘草次酸对自由基的清除率数据表

3　结语

皮肤的衰老和色斑的沉积都与自由基有着密切的关系，而大多数合成类药物具有毒性且具有副作用，因此有必要寻找合适的天然抗氧剂来对抗和清除自由基。随着科学技术的进步，具有清除氧自由基的作用的中药有效成分甘草次酸，将作为抗皱、美白等化妆品的主要成分，具有发展潜力。本文建立了石墨烯修饰电极的电化学分析方法测定了甘草次酸对·OH、ROOH、O2·-自由基的电化学行为，这种方法具有成本低、灵敏度高、且易于操作等优点。实验测定结果满意。

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