苗宗宁，吴卫江，钱寒光，赵基栋

（江苏无锡市第三人民医院，江苏 无锡214041）

1 引 言

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一类起源于神经外胚层，具有自我更新能力并在一定条件下分化为神经元和胶质细胞的多潜能干细胞［1-3］。胚胎期和成人中枢神经系统均发现有神经干细胞，其存在于特殊的niches中，通过自分泌或旁分泌的方式可以产生多种神经细胞因子，神经递质等特异性的功能蛋白［4-5］。研究表明移植NSCs可有效地修复损伤的脊髓组织，重建神经间的连接，治疗脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）［6-9］。NSCs主要存在于哺乳动物侧脑室的室管膜下区和海马的齿状回颗粒下层以及脊髓中央管室管膜区等［10］。本实验采用无血清培养法进行新生大鼠海马NSCs体外分离培养，观察其在体外增殖、分化等一系列细胞形态学变化，为细胞移植治疗SCI提供有效的细胞来源。

2 材料与方法

2.1 实验动物

新生SD大鼠，由江苏省血吸虫病防治研究所提供，许可证号SCXK（苏）2007-0021。

实验试剂及材料：DMEM/F12培养基，胎牛血清，Penicillin-Streptomycin，StemPro Accutase（Gibco）；B-27（Invitrogen）；表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子（Pepro Tech）；兔抗大鼠nestin单克隆抗体，兔抗大鼠GFAP单克隆抗体，兔抗大鼠NSE多克隆抗体，FITC标记的山羊抗兔Ig G（abcam）；DAPI，多聚赖氨酸（Sigma）；IX-71荧光显微镜（O-lympus）；CKX41倒置显微镜（Olympus）；培养瓶，离心管，移液管（Corning）；sABC试剂盒（BOSTER）；CO2细胞培养箱（Thermo）。

2.2 方法

2.2.1 新生大鼠海马神经干细胞分离培养及鉴定 取新生SD大鼠（出生24 h以内），颈椎脱臼法处死，碘酒浸泡1 min后75%乙醇漂洗3次×2 min/次。剪开头皮及颅骨，在解剖显微镜下，分离出海马区脑组织。用显微镊剥除脑膜及血块并用预冷的D-Hank’s液漂洗2次……