王发，张秉华，王嫦鹤，李继

(陕西省食品药品检验所，陕西 西安　710061)



◇药物分析◇

高效液相色谱法测定混合核苷片中四种核苷的含量

王发，张秉华，王嫦鹤，李继

(陕西省食品药品检验所，陕西 西安710061)

目的建立高效液相法同时测定混合核苷片中腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷含量的方法。方法采用C18( 250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相：以0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：260 nm。用保留时间定性，以峰面积按外标法定量。结果四种核苷分离良好，线性关系良好(r=0.999 6)，平均加样回收率在98.4%～101.9%， RSD%≤2.7%。结论本方法简便、准确，可用于混合核苷片中四种核苷的定性和定量分析。

色谱法,高压液相;嘌呤核苷类/分析;嘧啶核苷类/分析

混合核苷片是由腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷和胞嘧啶核苷组成的复方制剂，临床用于急慢性肝炎、肝损伤及肝硬化的辅助治疗。也可用于因辐射及放疗或化疗引起的白细胞减少症和非特异性血小板减少症或白细胞减少症[1]。现行国家标准[2]采用紫外分光光度法对制剂中核苷混合物的总量进行了控制，本文参考相关文献[3-12]，建立了混合核苷片中腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷和胞嘧啶核苷的含量测定的高效液相色谱法，实验结果表明，本方法简便、准确，可用于该品种的质量控制。

1　仪器与试药

高效液相色谱仪：Waters Alliance HT，waters 2478紫外检测器；赛多利斯BBS-224S型电子分析天平；SCQ-200型超声波清洗器。

鸟嘌呤核苷(批号：BCBL1474V)购自SIGMA公司，腺嘌呤核苷(批号：122388)、尿嘧啶核苷(批号：1134349)、胞嘧啶核苷(批号：1138698)均购自Aladdin公司，以上对照品纯度均≥99.0%，为方便计算，均按100%计算；混合核苷片(A公司，批号：110604，110605，110606)；试剂：磷酸二氢钾(西安试剂厂)、分析纯，甲醇(美国天地公司)、色谱纯，高纯水。

2　方法

2.1色谱条件色谱柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液为流动相A；甲醇为流动相B，梯度洗脱：0～22 min，99%～99% A，22～25 min，99%～95% A，25～40 min，95%～90% A，40～50 min，90%～90% A，55～55 min，90%～99% A，55～60 min，99%～99% A；检测波长：260 μm；流速：1.0 mL·min-1；柱温为30℃；进样量：10 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品储备液

精密称取胞嘧啶核苷23.34 mg，置于100 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为胞嘧啶核苷对照品储备液。精密称取鸟嘌呤核苷11.67 mg，腺嘌呤核苷11.37 mg、尿嘧啶核苷11.53 mg，同置于100 mL量瓶中，再精密加入胞嘧啶核苷对照品贮备液10 mL，加水适量溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。

2.2.2供试品溶液

取本品20片，精密称定，研细，精密称取约0.2 g，置100 mL容量瓶中，加入纯化水适量，超声(功率200 W，频率50 kHz)溶解10 min冷却至室温，用水稀释到刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性样品溶液

按处方比例制备不含混合核苷的阴性样品，按供试品溶液项下方法制备相应的阴性样品溶液。

注：1.胞嘧啶核苷;2．尿嘧啶核苷;3．鸟嘌呤核苷;4．腺嘌呤核苷。

3　结果

3.1方法学考察结果

3.1.1线性关系试验

精密量取对照品储备液适量，用水逐步稀释，得到如下系列浓度对照品混合溶液，鸟嘌呤核苷：116.70、58.35、29.18、11.67、5.84 mg·L-1，腺嘌呤核苷：113.70、56.85、28.42、11.37、5.68 mg·L-1、尿嘧啶核苷：115.30、57.65、28.82、11.53、5.76 mg·L-1、胞嘧啶核苷：23.34、11.67、5.84、2.33、1.17 mg·L-1。精密量取上述溶液各10μL注入液相色谱仪进行测定，以各组分峰面积Y对相应浓度X进行线性回归，鸟嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷线性方程分别为Y=52 307.37X-37173.14，r=0.9996；Y=59 490.20X-43724.37，r=0.9996；Y=42 507.77X-34130.45，r=0.9996；Y=26 918.15X-4374.42，r=0.9996。线性范围分别为：5.84～116.70、5.68～113.70、5.76～115.30、1.17～23.34 mg·L-1。

3.1.2精密度试验

取鸟嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷浓度分别为29.18、28.42、28.82、5.84 mg·L-1的对照品混合溶液，连续进样6次，鸟嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷峰面积的RSD分别为0.4%、0.3%、0.3%和0.6%。

3.1.3重复性试验

取批号为110604的供试品，按供试品溶液制备方法处理6份，按上述色谱条件进样测定，结果鸟嘌呤核苷含量均值为1.64 mg·片-1，RSD为1.1%，腺嘌呤核苷含量均值为2.10 mg·片-1，RSD为1.2%、尿嘧啶核苷含量均值为1.90 mg·片-1，RSD为0.4%、胞嘧啶核苷含量均值为0.71 mg·片-1，RSD为1.4%。

3.1.4稳定性试验

将新配制的供试品溶液，分别于0，1，4，8，10和12 h各进样10 μL，鸟嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷峰面积的RSD分别为0.8%、1.5%、1.2%、1.7%。

3.1.5定量限试验

取鸟嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷浓度分别为29.18、28.42、28.82、5.84 mg·L-1的对照品混合溶液，逐步稀释，以按上述色谱方法进样，记录色谱图，当所测组分的信噪比为10∶1时，鸟嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷对应的质量浓度分别为1.17、1.14、1.15、0.58 mg·L-1。

3.1.6回收率试验

取批号为110604的样品，研细，精密称定9份，每份约0.15 g，置100 mL容量瓶中，分别加入对照品储备液各1.0,2.0,3.0 mL，按3.2制备方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。结果鸟嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷的回收率分别为99.2%、100.6%、101.9%、98.4%，RSD分别为2.2%、2.7%、2.4%和2.2%。

3.2样品含量测定取样品，按供试品溶液制备方法制备样品，测定含量，结果见表1。

表1　样品中4种核苷的含量/mg·片-1

4　讨论

4.1提取时间的选择取同一样品，分别超声提取5、10、15 min，测定含量，结果见表2。由表2可知，10 min后的提取率基本相同，因此提取时间确定为10 min。

表2　同一样品不同提取时间4种成分含量/mg·片-1

4.2提取溶剂的选择混合核苷片中鸟嘌呤核苷，腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷四种组分均易溶于水，采用水作提取溶剂，具有干扰小，不污染环境等优点。相比与原标准中使用具有放射性的试剂醋酸氧铀，更具有保护检验人员健康安全的优势。

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Simultaneous determination of four nucleosides in Mixed Nucleoside Tablets by HPLC

WANG Fa1,ZHANG Binghua1,WANG Changhe1,et al

(ShaanxiProvinceInstituteforFoodandDrugControl,Xi’an,Shaanxi710061,China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of four nucleosides in Mixed Nucleoside Tablets.MethodsThe separation was performed on C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm),eluted with 0.01 mol·L-1potassium dinydrogen phosphate solution and methanol in gradient mode.The flow rate was 1.0 mL·min-1,and the detection wave length was 260 nm.With the retention time as for qualitative analysis,the peak area was quantified by the external standard method.ResultsFour nucleosides were separated well with good linear relation(r=0.999 6).The average recoveries were between 98.4% and 101.9%,and RSD was lower or equal to 2.7%．ConclusionThe method was simple and accurate,so it can be used for the quantitative and qualitative detection of four nucleosides in Mixed Nucleoside Tablets.

Chromatography,high pressure liquid;Purine nucleosides/analysis;Pyrimidine nucleosides/analysis

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.009

2016-02-21，

2016-04-27)