曾俊芬，王新桂，鲁建武，宋金春

(1.武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉　430060；2.湖北省中医院药事部，湖北 武汉　430061)



桂枝汤方剂不同提取部位免疫抑制活性的考察

曾俊芬1，王新桂2，鲁建武1，宋金春1

(1.武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉430060；2.湖北省中医院药事部，湖北 武汉430061)

目的筛选桂枝汤方剂免疫抑制活性部位。方法处方药材分别水煎浓缩为水提部位，乙醇提取为乙醇提取部位。同时将乙醇部位分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取得石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部和正丁醇部位。CCK-8法考察桂枝汤不同提取物对ConA激活T细胞和LPS激活B细胞增殖的抑制作用。同时用二硝基氯苯对昆明种小鼠皮肤致敏和诱发，制成迟发型超敏反应模型，观察桂枝汤方剂不同部位对迟发型超敏反应的干预作用。结果桂枝汤方剂水提物、乙醇提取物、石油醚萃取部位有显著免疫抑制功效，乙醇和石油醚提取物效果最佳。浓度200 mg·L-1时T细胞增殖抑制率分别为48.3%、45.9%，B细胞抑制率大于30%。乙醇提取物、石油醚萃取部位对迟发型超敏反应小鼠耳廓肿胀有显著抑制作用，对胸腺和脾脏无明显影响。结论桂枝汤方剂乙醇提取物和石油醚萃取物为免疫抑制活性部位，能显著抑制T细胞和B细胞的增殖，抑制小鼠耳廓肿胀，对正常细胞、胸腺、脾脏无毒性。

桂枝汤/分析;化学分馏法;超敏反应,迟发型;催化域

桂枝汤来源于《伤寒论》，该方由桂枝、生姜、甘草、白芍、大枣组成，有解肌发表，调和营卫的功效。临床上常将桂枝汤用来抗过敏反应和抑制炎症，以及治疗风湿等疾病[1]。过敏反应、风湿等属于自身免疫性疾病，有研究表明桂枝汤可通过免疫抑制和抗炎作用达到抗过敏治疗风湿的作用[2-4]，但并未有其活性部位的研究报道。免疫抑制作用被广泛应用于控制一些异常的免疫应答反应，中药来源的免疫抑制剂有作用广、毒性小、药价低等特点，开发与研究中药的免疫抑制作用，具有广阔前景。本文以免疫抑制作用为考察指标对桂枝汤不同部位的免疫抑制活性进行了探讨。

1　材料

1.1实验动物BALB/c小鼠，体重18～20 g，4～6周龄，购自华中科技大学同济医学院动物实验中心，动物合格证号:SCXK(鄂) 2014-0013。清洁级雄性昆明小鼠，体重(20±2)g，购自武汉大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(鄂)2015-0007。

饲养温度(22±1) ℃，湿度(55±5)%，12 h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取，所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。

1.2药物及试剂桂枝(批号20141103)、生姜(批号20150201)、甘草(批号20141005)、白芍(批号20141010)、大枣(批号20150304)均购于湖北天济中药饮片有限公司；RPMI Medium 1640 培养基(Gibco，批号：11875093)；二甲基亚砜(DMSO，上海国药)；小牛血清(Logan)；刀豆蛋白A(Con A，Sigma，批号：C5275)；LPS(Sigma，批号：L2630)；CCK-8(碧云天生物技术研究所，批号：C0038)。2,4-二硝基氯苯(DNCB)(上海化学试剂公司，批号：20140317)，地塞米松磷酸钠注射用粉针(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：140208)。

1.3仪器设备CO2培养箱：德国Heraeus公司；SW-C型超净工作台：上海锦屏仪器仪表有限公司；SPECTRAMAX Plus型酶标仪：美国Molecular Devices；TL-18M台式高速冷冻离心机：上海市离心机械研究所；BL150S电子天平：德国Sartorius；直径8 mm的金属打孔器。

2　方法

2.1药品制备按桂枝汤处方配齐药物(桂枝10 g、芍药 10 g 、生姜 10 g 、甘草 7 g 、大枣 10 g)47 g，水煎2次合并药液，过滤浓缩为水提部位8.5 g(浸膏得率18.1%)备用。另按方将药物粉碎(235 g)，95%乙醇室温提取3次，每次一周，提取液减压浓缩后得乙醇提取部位39 g(得率16.6%)，取适量乙醇提取部位备用。其余乙醇提取部位用热水混悬，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、 正丁醇溶液萃取并减压浓缩各萃取液，分别得石油醚部位6.1 g干浸膏、氯仿部位3.8 g干浸膏、乙酸乙酯部6.7 g干浸膏和正丁醇部位7.6 g干浸膏。

2.2小鼠脾淋巴细胞悬液的制备BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死后摘取脾脏，PBS清洗后放至Mesh网上研磨，1500 rpm离心15 min，弃上清加入红细胞裂解液3 mL，混匀并避光5 min，再加入7 mL PBS终止裂解液，1 800 r·min-1，离心10 min，弃上清，加入含小牛血清的RPMI-1640 3 mL混匀，吸取10 μL混悬液，加入90 μL台酚蓝染色计数，细胞活率达95%以上，制成密度为5×109个·L-1的脾淋巴细胞。

2.3CCK-8法检测化合物对小鼠脾脏淋巴细胞活性的影响[5]实验分为空白对照组(100 1500 rpmμL细胞悬液+100 μL RPMI-1640)，细胞毒实验组(100 μL细胞悬液+50 μL化合物+50 μL RPMI-1640)，ConA对照组(100 μL细胞悬液+50 μL ConA+50 μL RPMI-1640)，LPS对照组(100 μL细胞悬液+50 μL LPS+50 μL RPMI-1640)，T细胞实验组(100 μL细胞悬液+50 μL ConA+50 μL萃取物)，B细胞实验组(100 μL细胞悬液+50 μL LPS+50 μL萃取物)。实验组各部位取适量干浸膏，DMSO溶解后再RPMI-1640稀释至所需浓度。

小鼠脾脏淋巴细胞悬液2.5×106/孔接种于96孔板，加入ConA(终浓度5 mg·L-1)，加入LPS(终浓度10 mg·L-1)，同时加入不同部位提取物(浓度分别为10、50、200 mg·L-1)，并设相应的无ConA、LPS对照孔以及无药物对照孔(建立ConA激活的T细胞增殖模型和LPS激活的B细胞增殖模型)，每组浓度设3个孔。放置于37℃，5% CO2培养箱中培养48 h，结束培养前8～10 h加入CCK-8溶液。至培养结束，于酶标仪450 nmol·L-1(参比650 nmol·L-1)处测定OD值。分别计算细胞存活率和细胞增殖抑制率，当抑制率大于10%即可考虑有免疫抑制活性的趋势。通过检测T细胞和B细胞的变化，反映受试药物对免疫调节的影响，从而说明桂枝汤不同部位的免疫抑制作用，结果见表1。

细胞存活率=(试验组OD平均值 / 空白对照组OD平均值)×100%

抑制率=[(试验组OD平均值-对照组OD平均值) /对照组OD平均值] ×100%

2.4迟发型超敏反应小鼠模型[6]将小鼠随机分为8组，每组10只，分别为模型组、水提组、乙醇提组、石油醚萃取组、氯仿萃取组，乙酸乙酯萃取组、正丁醇萃取组、阳性对照组(地塞米松)。各组小鼠每天给药一次，连续给药7 d。实验第1天将各组小鼠腹部刮毛面积约2 cm×2 cm，第2天和第3天于刮毛部位涂5%二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液。第7天用1%DNCB丙酮溶液涂布于左耳进行攻击，右耳涂布丙酮溶液作为对照。攻击24 h后(即第8天)于给药后1 h，小鼠处死，用打孔器在左右耳同一位置打下两只耳片，并取出胸腺及脾脏，称重，计算肿胀度，胸腺和脾脏指数。

表1　桂枝汤方剂不同部位对T细胞和B细胞增殖的抑制率

注：与对照组比较,aP<0.05,bP<0.01。

3　结果

3.1桂枝汤方剂对免疫细胞增殖的抑制作用实验结果如表1所示，所有部位在高浓度时对ConA诱导的T细胞增殖均有一定的免疫抑制功效。除氯仿和乙酸乙酯萃取物，其它部位对LPS诱导B细胞增殖也有不同的抑制作用。水提物、乙醇提物、石油醚萃取部位高浓度时均能显著抑制T细胞增殖，尤其乙醇提取物和石油醚萃取物在50和200 mg·L-1时抑制效果相当，对T细胞抑制率分别大于30%和45%(P<0.05；P<0.01)，在200 mg·L-1时对B细胞抑制率大于30%(P<0.05)，同时结果还显示所有部位对正常细胞没有影响。

3.2对迟发型超敏反应小鼠的作用实验结果表明桂枝汤方剂的乙醇提物、石油醚萃取物能减轻小鼠耳廓的肿胀程度，与模型组相比这两组耳廓肿胀度差异有统计学意义(P<0.05)，说明对小鼠的变应性接触性皮炎有明显的改善作用。而桂枝汤方剂各组对免疫器官胸腺和脾脏无显著抑制作用(表2)。

表2　桂枝汤方剂对迟发型超敏反应小鼠的影响

注：与模型组比较，aP<0.05,bP<0.01。

4　讨论

脾脏是机体重要的免疫器官，是成熟的T、B 细胞存在和参与免疫应答的重要场所。脾内淋巴细胞中T细胞占约40%，B细胞占约55%，因此体外培养小鼠原代脾淋巴细胞被认为是研究淋巴细胞比较合适的方法。ConA和脂多糖(LPS)作用于脾细胞，可分别刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，是用来检测两种细胞功能的常规方法。CCK-8法灵敏度高，数据可靠，重现性好，且对细胞毒性低，已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。本课题中运用CCK-8法对植物提取物进行活性筛选，能快速检测试药对小鼠脾脏淋巴细胞活性的影响。实验结果显示氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物高浓度时(200 mg·L-1)也有一定抑制作用，但低剂量时对B细胞增殖几乎无影响。水提物、乙醇提物、石油醚萃取部位ConA诱导的T细胞增殖和LPS诱导B细胞增殖均有显著抑制作用，且乙醇和石油醚的活性优于水提物。

2,4-二硝基氯苯诱导的迟发型超敏反应是一种皮肤接触小分子半抗原所引起的接触性超敏反应，是T细胞介导的炎症反应。本研究采用这种典型的迟发型超敏反应的动物模型，以期追踪其该作用的活性部位。结果显示桂枝汤方剂的乙醇提物、石油醚萃取物对迟发型超敏反应引起的小鼠变应性接触性皮炎有明显的改善作用，提示桂枝汤方剂抑制迟发型超敏反应的免疫抑制作用部分为乙醇提物和石油醚萃取部分。

水提物是桂枝汤处方各药材经过高温煎煮得到，药材在煎煮过程中高温对各药材中的成分产生影响，其有效成分会随高温减少发生化学变化，影响药效。乙醇提取物是在室温条件下提取，温度未对各药材成分产生影响，且三次提取能较完全将药材中有效成分提取，因而其药效得以充分发挥。本试验中乙醇提取部位用极性由低到高的不同溶剂萃取，得到不同极性的部位，易使极性相同的活性成分富集而使不同部位产生不同活性。桂枝汤方剂中主要药材为桂枝、生姜、甘草、白芍等，桂枝主要成分为桂皮醛、桂皮酸、醋酸苯丙酯、醋酸桂皮脂、肉桂醇、香豆素等挥发油[7]，研究发现桂枝挥发油有免疫抑制功能[8-9]；生姜中含有有α-姜烯、反-β-金合欢烯、α-金合欢烯、β-红没芍烯等挥发油，有抗炎作用，且能抑制T细胞增殖的免疫抑制作用[10]，同时桂枝汤方剂中的甘草含有甘草素、甘草查耳酮A和甘草酸具有抗炎抗变态的作用[11]，白芍中主要成分为白芍苷，其具有较好的抗炎镇痛作用[12]。石油醚极性较低，萃取桂枝汤乙醇提取部位时易将其中低极性的挥发油成分富集在石油醚部位，石油醚萃取部位可能因富含挥发油而免疫抑制活性优于其他萃取部位。

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Screening for immunosuppressive function on different fraction of Guizhi Decoction

ZENG Junfen1,WANG Xingui2,LU Jianwu1,et al

(1.DepartmentofPharmacy,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China;2.DepartmentofPharmacy,HubeiProvincialHospitalofTCM,Wuhan430061,China)

ObjectiveTo screen the immunosuppressive fraction of Guizhi decoction.MethodsMedicinal materials of Guizhi decoction was extracted by water and ethanol to get water extraction and ethanol extraction.Ethanol extraction was extracted with petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butanol to get petroleum ether fraction,chloroform fraction,ethyl acetate fraction,and n-butanol fraction respectively.CCK-8 method was used to detect the activity of different extracts on lymphocytes in the spleen of mice.ConA and LPS were added to the spleen cells of BALB/c mice to activate T cells and B cells respectively.Different extracts of Guizhi decoction were added to the activated spleen cells to investigate the immunosuppressive effect.The model of delayed-type hypersensitivity was established by sensitizing the skin of Kunming mice with DNCB.Effects of different fractions of Guizhi decoction were observed on delayed-type hypersensitivity mice.ResultsWater extraction,ethanol extraction and petroleum ether fraction had significant immunosuppression.Ethanol extraction and petroleum ether fraction showed the greatest activities with inhibitory rates of T cells 48.3% and 45.9%,and B cells inhibitory rate was more than 30% at the concentration of 200 mg·L-1.Ethanol extraction and petroleum ether fraction could alleviate obviously the degree of swollen-auricle of mice and without significant influence on spleen and thymus.ConclusionsThe ethanol extraction and petroleum ether fraction were the main immunosuppressive fraction,which could significantly inhibit the proliferation of T and B cells and alleviate the swollen-auricle of mice without toxicity to normal cells and spleen and thymus.

Guizhi decoction/analysis;Chemical fractionation;Hypersensitivity,delayed;Catalytic domain

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.004

2016-03-23，

2016-06-11)