朱 玲　贾昌路　张 锐

(1 塔里木大学植物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)(2 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)(3 塔里木大学生命科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)



木质素生物合成及其关键酶基因的研究进展

朱 玲1,2贾昌路1张 锐2，3*

(1 塔里木大学植物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)(2 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)(3 塔里木大学生命科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)

木质素是一种植物体内重要的大分子有机物质，其含量仅次于纤维素。在增强植物体机械强度、抵御外界不良环境侵袭以及疏导组织水分运输等方面起着重要作用。木质素的含量及组成对果实品质及抗逆性等有重要的影响，如核桃内果皮中木质素的含量及组成对于核桃的果实品质、内果皮发育、果皮的完整性(露仁)等有直接影响。因此，本文重点对植物木质素生物合成及其关键酶基因的研究进展进行综述，为从木质素合成领域着手改良果实品质奠定理论基础。

木质素； 生物合成； 关键酶

木质素(Lignin)是一种植物体内重要的大分子有机物质，出现在次生加厚的细胞壁中,其含量仅次于纤维素[1]。它与纤维素、半纤维素是构成植物骨架的主要成分，被称为组成植物体的“三素”。木质素作为植物细胞壁的重要组分，以包容物质的形式分散在纤维素之中及其周围。它不仅能增强植物体机械强度及细胞壁的硬度，并且具有抵御外界不良环境侵袭及疏导组织水分运输等多种生物学功能[2,3]。木质素在农业中应用广泛，例如在肥料、农药、饲料、植物生长调节剂等方面具有非常重要的作用[4]。

在过去几十年间，众多学者利用分子生物学及生物化学等方法对木质素进行深入地研究和探索，使人们对于木质素的生物合成及与其相关的酶基因有了进一步的了解。近年来，多种与木质素生物合成相关酶的编码基因被分离出来并进行了克隆和分析。学者们通过调控木质素生物合成途径中关键酶基因的表达，使相应的酶活性发生改变，从而阻断或促进木质素的生物合成途径。最终造成木质素含量或单体组成发生变化的目的，进而可以改良植物的应用特性。核桃是由内果皮(硬壳)及种仁组成，其内果皮中木质素的含量及组成直接影响到了核桃果实的品质。因此，本文对于目前木质素生物合成及其关键酶基因的研究进展做一简要综述，为今后从木质素合成方面研究核桃等核果类果实的内果皮发育，进而改良果实品质等方面的研究奠定一定的理论基础。

1　木质素的构成

木质素是存在于高等植物中的一种三维网状的天然高分子聚合物，由苯丙烷单体聚合而成。香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)、和芥子醇(sinapyl alcohol)这3种苯丙烷单体被认为是高等植物中组成木质素的三种主要的单体，并且根据这些单体来源的不同可将木质素分为3种类型：第一类是由对-羟基苯基丙烷单体(香豆醇)聚合而成的对-羟基苯基木质素(hydroxy-phenyl lignin，H-木质素)；第二类是由愈创木基丙烷单体(松柏醇)聚合而成的愈创木基木质素(guaiacyl lignin，G-木质素)；最后一类是由紫丁香基丙烷单体(芥子醇)聚合而成紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)[5,6,7]。这三种类型的木质素在不同类型的植物体中的分布不同，如H-木质素在禾本科植物中分布较为广泛，G-木质素广泛的分布在被子植物和裸子植物中，而S-木质素主要分布于被子植物中[8]。此外，随着人们对于木质素生物合成途径进一步的认识和了解，发现自然界中的木质素单体并不止以上三种苯丙烷单体类型，还有其它形式的单体同样参与到了木质素的生物合成，Lu等[9]在一些植物中发现，乙酰化的木质素单体在木质素组成中占有一定的比例。

2　木质素的生物合成途径

木质素的生物合成是一个极其复杂的过程，其生物合成途径大体可分为3个主要的过程：首先各种苯丙烷单体通过多种相关的酶催化后合成相应木质素单体；然后这些木质素单体进行储存和运输；最终这些木质素单体直接羟化聚合为木质素。由此看出，木质素单体的生物合成是木质素生物合成途径中最关键的过程，因此木质素的生物合成途径主要是指木质素单体的生物合成途径。有研究表明，木质素单体是在植物细胞质中完成合成的，再通过醚键、酯键或碳-碳键等化学键连接在一起，然后转运至相应的木质化沉积位点进行储存，最后在细胞壁中脱氢羟化聚合成木质素[10,11]。

经过国内外许多专家学者对木质素几十年的研究，虽然至今对木质素单体的具体代谢途径尚未完全清楚，但人们广泛认同的木质素单体合成途径大致可分为3个步骤[5,6,12]：(1)莽草酸代谢途径：植物光合作用后的同化产物到苯丙氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸的合成过程；(2)苯丙烷代谢途径：从芳香族氨基酸到羟基肉桂酸及其辅酶A酯类化合物的过程；(3)木质素合成的特异途径：从羟基肉桂酸及其辅酶A酯类到合成木质素单体及其脱氢羟化聚合成木质素的过程。现阶段，人们广泛认同的木质素单体合成途径如图1所示。苯丙烷代谢途径以及木质素合成的特异途径被认为是在木质素单体的合成途径中主要的途径。研究表明，有多种酶参与到这两种途径中，如：苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanine ammonia-lyase ，PAL)、肉桂酸4-羟基裂解酶(Cinnamate 4-hydroxylase ，C4H)、香豆酸3-羟基化酶(Coumarate 3-hydroxylase ,C3H)等是苯丙烷代谢途径的关键酶；而在木质素合成的特异途径中的关键酶有：香豆酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase ,CCR)肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase ,CAD)等[12,13]。

图1　木质素单体生物合成途径[14]

注:PAL:苯丙氨酸裂解酶，Phenylalanine ammonia-lyase; C4H:肉桂酸-4-羟基化酶，Cinnamate 4-hydroxylase ;4CL:4-香豆酸辅酶A连接酶，4-hydroxycinnamate CoA ligase; C3H:香豆酸-3-羟基化酶，Coumarate 3-hydroxylase; CCoAOMT:咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶，Caffeoyl-CoA O-methyltransferase; F5H:阿魏酸-5-羟基化酶，Ferulate-5-hydroxylase;COMT:咖啡酸氧甲基转移酶，Caffeicacid/5-hydroxy coniferaldehyde O-methyltransferase; CCR:肉桂酰辅酶A还原酶，Cinnamoyl-CoA reductase; CAD:肉桂醇脱氢酶，Cinnamyl alcohol dehydrogenase。

3　木质素生物合成中关键酶基因的研究进展

3.1苯丙氨酸解氨酶(PAL)

PAL是木质素单体生物合成途径中的首个关键酶，是苯丙烷代谢途径中的第一限速酶，也是苯丙烷代谢途径中研究最多的酶，它可使苯丙氨酸被催化脱氨基生成反式肉桂酸[15]。 PAL几乎存在于所有绿色植物中，目前已从小麦、苜蓿、石斛、枸杞、番茄等几十种植物中成功获得了PAL的编码基因[16-20]。一般认为植物中的PAL基因属于多基因家族，至少含有3到4个亚型[21]。Ujwal研究发现[22]，在火炬松中至少存在5个不同的PAL基因(ptPAL1-5)。PAL是最早被鉴定的植物防御性基因之一，有研究表明PAL与植物的防御生理与应激有着密切的联系，并受病原和环境胁迫等因素诱导表达[23]。PAL在植物细胞分化和木质化过程及抗病与抗虫害、抗旱、抗寒等方面起到极其重要的作用[24]。

有研究表明，抑制了PAL表达的转基因烟草，无论是正义或是反义抑制其PAL活性，都会导致木质素含量的降低，并伴随S/G比值的升高，同时其生长发育亦受到了严重的影响[25]，即导致该植物出现非正常生长或者出现对环境适应性的下降现象。这些非正常生长是包括植物的生长变得缓慢或停滞生长，次生木质部细胞壁变薄，抵御病害的能力下降。造成这一现象的原因可能是由于苯丙烷代谢产物与其它次生代谢产物的合成密切相关，PAL活性的抑制，影响了其它木质素等代谢产物的合成。由于PAL的特殊位置，其活性的高低变化对于整个苯丙烷代谢途径至关重要，故调控PAL基因会导致木质素生物合成途径产生变化，从而严重影响其它产物的合成，因此很有可能会导致植物性状的变化。

3.2肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)

C4H属于植物细胞色素P450的cYP73亚族，是一种单氧化酶。C4H是苯丙烷代谢途径的第二个关键酶，能利用PAL催化产生的肉桂酸催化其C4位置，羟基化形成对-羟基香豆酸[27]。

有研究发现，当C4H酶的活性受到抑制后，转基因烟草的木质素含量明显减少，同时，调控C4H表达还会造成木质素构成的改变，使得S/G比值会降低，但生长无异常现象[28]。出现这一现象的原因可能是由于木质素单体的生物合成早在苯丙烷代谢途径的入口处就可能发生了S和G的特异性分支。同时，也有可能是由于C4H对S木质素的生物合成具有非常强的调控能力，而G木质素的合成途径也许能够跨越C4H的催化步骤，因此会出现这种结果。但这一结果还有待分子生物学及其他相关学科提供有效的证据支撑。

3.34-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)

4CL是苯丙烷代谢途径中的最后一个关键酶，通常以基因家族形式存在于植物中，4CL可将羟基肉桂酸乙酰化生成羟基肉桂酰-CoA酯[29]。目前，已从桑树[30]、棉花[31]、光皮桦[32]等十几种植物中成功克隆出4CL编码基因。

通过对多种转基因植物的研究发现，不同植物的4CL功能并不相同，在不同的植物中所得结果也不一致。早期研究发现，抑制4CL活性会导致烟草和拟南芥等植物的木质素含量下降[30,31]，但S/G比例的变化不尽相同。有研究表明，抑制转基因拟南芥的4CL活性后，导致S/G的值降低，其中S-木质素含量下降，但G-木质素无明显变化[33]。然而转基因烟草的4CL活性被抑制后，虽然S-木质素和G-木质素含量均降低，但与转基因拟南芥的结果不同的是，G-木质素降低幅度大于较S-木质素[34]。同时，这两种转基因植物的生长特性也出现了差别，拟南芥生长正常而烟草却出现了矮化现象。Hu等发现[35]转基因杨树的茎中木质素含量下降，S/G比值却无明显变化。贾彩红等[36]研究发现，当4CL活性被抑制后，可导致转基因毛白杨木质素含量的降低。根据以上几种植物的研究结果发现，抑制4CL活性的转基因植物的木质素含量均表现出下降的趋势，这表明4CL在木质素单体生物合成途径中为起到限速酶的作用，但其具体功能因植物种类而异。

3.4香豆酸-3-羟基化酶(C3H)

C3H是木质素生物合成中关键酶之一，研究相对较晚。其作用是催化肉桂酸向香豆酸的转化，最适催化底物是甲酰肉桂酯类化合物[37]。Franke等[38]利用图位克隆方法从拟南芥中成功分离出REF8基因，并证实该基因编码C3H，属于CyP98A3基因家族中的成员，且得出C3H实质上是一种细胞色素P450单氧化物酶这一结论。研究者们还从‘欧美杨107’次生木质部RNA中克隆出木质素合成酶C3H基因片段，初步断定其为CYP98A3家族中的一员[39]。C3H作为调控木质素单体生物合成途径的关键酶，对于植物的综合利用有着重要的意义。但目前对C3H遗传特性的认识还比较浅显，关于对调控该酶的活性从而影响植物体木质素含量的研究也相对较少。

3.5肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)

CCR是木质素合成特异途径的第一个关键酶，它可以催化羟基肉桂酰辅酶A类物质，使其进行还原反应，生成相应的肉桂醛。通过生物信息学分析，得知CCR基因同C3H、4CL基因一样，所编码的主要氨基酸种类均为Val、Ala及Gly，说明这3种氨基酸可能与木质素合成过程中的关键酶有重要联系[40]。有报道认为CCR对木质素生物合成途径中的碳流具有潜在的调控作用[41]，因此它的负调节可能会对植物体中木质素含量产生一定的影响。陈刚等[42]发现同一品种、不同组织中CCR基因的表达量存在组织特异性，表达量与组织木质化的程度呈正相关[42]。有研究表明CCR转基因烟草的木质素含量降低，但导管塌陷，且生长量减少[43]。Goujon等[44]研究发现，反义抑制转基因拟南芥中的CCR基因，使木质部中木质素含量明显减少，且其次生壁结构松弛，呈现非正常生长。韩伯涛等[45]将CCR基因以正义反义和干涉的形式通过农杆菌介导的方法转入烟草中，结果发现，在获得的转基因植株中所有下调基因的植株，木质素含量有明显的下降趋势，纤维素含量则有所上升。植物细胞壁组分的含量变化表明CCR基因也许是一个控制木质素代谢途径的一个很好的调控点。

3.6肉桂醇脱氢酶(CAD)

CAD是木质素合成的特异途径的关键酶之一，通过氧化还原反应催化3种相应的肉桂醛(香豆醛、芥子醛、松柏醛等)变成肉桂醇，生成相应木质素单体的前体物质。CAD的基因表达和CAD酶活部位具有明显的组织特异性。张逢凯等[46]采用 RT-PCR 方法对 CAD 基因在根、侧枝、叶、芽四种组织中表达的特异性分析，结果显示，CAD 基因在马尾松侧枝中表达量最高，在叶、根和芽中亦有低水平表达。有研究发现，对拟南芥的AtCAD4和AtCAD5进行双突变后，木质素含量却明显下降[47]。目前已报道的CAD活性降低的转基因植物包括苜蓿[48]和玉米[49]等。在这些转基因植物中发现，当CAD活性受抑制时植株生长表现正常，木质素含量也无明显变化，S/G比值变化不明显[50]。

3.7咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)及咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)

COMT与CCoAOMT是木质素生物合成途径中两个不同底物水平上的甲基化酶，它们分别以3,4-二羟基和3-甲氧基、4,5-二羟基芳香核团上的取代基为作用位点[51,52]，在木质素生物合成代谢途径中形成两条平行的路径。

COMT被认为对S型木质素单体合成有重要的调控作用，当转基因植物中COMT活性被抑制到足够低时，木质素含量会减少[53]。CCoAOMT则被认为是G型木质素单体合成的重要调控基因[54]。在过去对木质素生物合成中关键酶的研究中，对COMT研究的较多。目前已从苜蓿[54]、梨[55]、茶树[56]等植物中成功克隆获得了COMT基因。与COMT相比，CCoAOMT在木质素生物合成途径中的作用研究相对较晚。近年来，通过反义抑制CCoAOMT的活性来调控植物体木质素含量的研究越来越多。目前已从柚[57]和青杨[58]等植物中成功克隆出了CCoAOMT并进行了超表达载体构建。吕萌等[59]研究发现，COMT和CCoAOMT在棉花的根，茎等维管组织中具有相对一致的高表达，而在其它组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。

3.8阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)

F5H是木质素生物合成的关键酶之一，催化羟基肉桂酸苯环C5的羟基化。通过对转基因植物和突变体的研究，发现F5H很有可能就是S-木质素的合成控制点。王轶男[60]等克隆毛白杨阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)基因全长序列，并通过生物信息学分析发现，F5H主要位于质体中，并含有19个磷酸化位点。植物的阿魏酸-5-羟基化酶是一个具有跨膜结构域的亲水性蛋白，在内质网等分泌途径中表达。李扬等[61]在甘蓝的茎组织中研究发现，抗倒伏材料F5H基因表达量的高于易倒伏材料，由此可以看出F5H具有组织特异性。F5H过量表达的转基因烟草、拟南芥等植物中S-木质素含量明显增加，而G-木质素生物合成明显受到抑制[62,63]。有研究表明，F5H催化的反应除了在肉桂酸水平进行外,还能够在醛和醇的水平上发生[64,65]，这说明木质素是通过不同的途径而生成的，这既是生物多样性的一种体现，也是生物对环境适应性的一种反应。

4　植物木质素研究展望

木质素的生物合成是一个极其繁琐而复杂的过程，近些年来，人们经过对木质素不断的探索和研究，虽然木质素生物合成途径已基本阐明但并不透彻。通过对木质素生物合成途径中关键酶的编码基因进行调控，从而改变植物体中木质素的含量及其组成已成为近几年研究的热点。这不仅有助于阐明木质素生物合成的分子机理，而且对于核桃等果树植物在实际生产中改良其果实品质方面具有重要的意义。大量的研究表明，正义或反义抑制木质素生物合成途径中的关键酶会造成植物生长异常等不利于植物生长的后果，并且这一传统方法对于木质素生物合成过程中关键酶的研究也并不全面。

木质素生物合成的调控涉及多层次、多种转录因子的协同作用。目前，NAC及MYB类转录因子都参与了对木质素生物合成的调控[66]。近几年，有证据表明，某些WRKY和bHLH(Basic helix- loop-helix)类转录因子同样也在木质素生物合成的调控中起到了关键作用[67-68]。随着高通量测序技术的发展，研究者有望在更多的物种中发现参与木质素生物合成调控的关键转录因子。有研究者经PCR扩增得到CCR基因的第4个外显子部分序列利用RNA干扰技术，培育低木质素杨树，结果表明转基因植株木质素含量与对照相比平均降低了9.86%[69]。胡可等[70]通过干扰CCR和CAD基因表达，获得了低木质素含量的多年生黑麦草。随着生物技术及分子生物学等相关学科的迅猛发展，为进一步探索研究木质素生物合成途径及其关键酶基因和寻找与木质素生物合成相关的新基因创造了更多的机会，采用RNA干扰技术及转录因子调控等手段必将成为今后研究植物木质素生物合成及其关键酶基因的重要方法，从而可为今后从木质素方向着手改良核桃等核果类果树的果实品质奠定基础。

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The Research Progress of Lignin Biosynthesis and Its Key Enzymes

Zhu Ling1,2Jia Changlu1Zhang Rui2,3*

(1 College of Plant Sciences, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300) (2Laboratory of Biological Resources protection in Tarim Basin, Xinjiang Production and Construction Corps, Alar, Xinjiang 843300) (3 College of Life Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

Lignin is one of important macromolecular organic materials, which content is lower than that of in botanic field. It plays an important role in enhancing plant mechanical strength to resist the undesirable descent from the outside environment and transporting the conducting tissue water. Lignin contents and composition have important effect on fruit quality and stress resistance, for example, the lignin contents and composition of walnut endocarp has direct influence, such as walnut fruit quality, endocarp development, the integrity of the endocarp (bared nut) and so on. Therefore, this paper focuses on plant lignin biosynthesis and summarizes the research progress of key enzyme genes in order to set a theoretical basis for the fruit quality improvement in the lignin synthesis field.

lignin; biosynthesis; key enzymes

2015-08-19

国家自然科学基金项目(31260469)；塔里木大学研究生科研创新项目(TDGRI201509)。

朱玲(1989-)，女，在读硕士2013级研究生，果树遗传育种方向。E-mail：bettyzl2015@163.com

�E-mail：843037930@qq.com

1009-0568(2016)03-0128-09

S664.1

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.03.022