文/山东绿都生物科技有限公司　李天芝　于新友

山东省滨州畜牧兽医研究院　沈志强

环介导等温扩增（LAMP）技术及其在猪细菌病病原检测中的应用

文/山东绿都生物科技有限公司李天芝于新友

山东省滨州畜牧兽医研究院沈志强

环介导等温扩增（LAMP）技术是一门新兴的分子生物学检测技术，因其具有特异性强、灵敏度高、快速、准确、操作简便和成本低等特点，越来越受到兽医相关工作者的关注。目前，该方法己被广泛应用于各种猪病病原的检测。文章综述了LAMP技术在猪细菌病病原检测中的应用研究进展，以期为今后猪细菌病的诊断和防控工作提供参考。

LAMP；猪细菌病；病原；检测；应用

猪细菌病对当今养猪业造成巨大的威胁，目前养殖场主要是将病料送到专业检测实验室进行病原分离鉴定或PCR检测，病原分离鉴定需要的时间相对较长，PCR检测又需要特殊的仪器设备，不适合基层实验室应用，一旦出现疫情，由于条件所限，很难实现对疫病的快速检测。日本学者Notomi等［1］开发了一种新型核酸扩增技术，即环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，该技术不需要模板的热变性［2］、长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程，整个反应在恒温条件下进行，反应结束后，结果可用肉眼直接观察［3］，在疫病诊断领域显示了广阔的应用前景。本文就LAMP技术及其在猪病病原检测中的应用研究进展综述如下。

1　LAMP技术

1.1LAMP扩增原理

LAMP技术是针对靶基因6个区域设计4条特殊引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右温度下，启动循环链置换反应，完成对目标DNA的大量扩增。在LAMP反应中，内引物杂交在目标DNA区，启动互补链合成，导致哑铃状DNA产生。这种结构很快以自身为板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，然后以此结构作为LAMP循环的起始结构。由于内引物杂交在茎-环的环上，引物链置换合成的DNA产生一个有缺口的茎-环DNA中间媒介，在茎上附有目标序列。再通过外引物，在茎的末端形成环状结构，结果在同一链上互补序列周而复始形成具有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。

1.2LAMP引物设计

首先在靶基因的3'末端设定F3c、F2c、F1c 3个区段，在5'末端设定B1、B2、B3 3个区段。针对这6个区段设计4条引物，包括1对内部引物和1对外部引物。上游内部引物FIP：在3'末端含有与F2c互补的F2区段，在5'末端含有与F1c相同序列的区段下游内部引物BIP：在3'末端含有与B2c互补的B2区段，在5'末端含有与B1c相同序列的区段。上游外部引物F3：含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。下游外部引物B3：含有与目标DNA的B3相同序列的区段，各引物组成及对应区域如下图1所示。引物的设计要注意以下几个问题：①扩增领域为F2～B2区段间，应该在200bp以内；②包含F2/B2在内的环状部分的长度在40～60bp范围内；③各区段的Tm值应该在60～65℃之间；④若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1～B1的间距可以为0；⑤引物应避免二次结构发生；⑥各引物的3'端不可含有与其他引物互补的序列。

1.3LAMP技术特点

LAMP技术具有以下特点：①操作简便、耗时短、成本低，扩增反应在等温下持续进行，只需在恒温水浴锅中几十分钟即可完成，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性，适合在基层养殖场推广应用；②扩增的效率高，没有PCR反应中温模板的退火、复性过程，在15～60min内可扩增109～1010倍，能满足临床病料样本快速检测的需要；③特异性高，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。针对6个区段使用4种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列；④灵敏度高，检测的敏感性是常规PCR的10倍，扩增模板可达10拷贝或更少；⑤仅使用一种链置换型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一种不耐热的DNA聚合酶，因此必须在模板预变性以后再加样；⑥扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构；⑦当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。

图1　LAMP的引物组成及对应区域

1.4反应产物的检测

LAMP反应产物的检测方法主要有5种：①以2%的琼脂糖凝胶电泳观察是否有典型的梯状条带泳判定结果；②以扩增产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生用肉眼直接判断扩增反应是否进行；③反应体系中加入溴化乙锭、SYBR Green Ⅰ等染料，通过观察扩增结果是否产生相应颜色来判定是否有目的片段扩增；④通过恒温扩增微流控芯片实时观察反应结果；⑤运用实时浊度仪监测反应结果。

2　在猪细菌病检测中的应用

2.1猪霍乱沙门氏菌检测

猪霍乱沙门氏菌是引起猪沙门氏菌病的主要血清型，主要感染断奶期仔猪，引发仔猪副伤寒，临床上以急性败血症、慢性坏死性肠炎、顽固性下痢等为特征，如果并发或继发感染其他疾病或治疗不及时，死亡率较高，给养猪业造成重大的经济损失，严重困扰着养猪业的健康发展。时建立等［4］根据猪霍乱沙门氏菌lacZ基因设计特异性引物，通过优化各种反应条件，建立了检测猪霍乱沙门氏菌的LAMP快速检测方法，该法特异性好，灵敏度高，将细菌DNA稀释到10-8仍可检出，是PCR方法的1,000倍。

2.2猪链球菌血清2型检测

猪链球菌2型（SS2）是一种重要的人兽共患病病原菌，它能引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，各年龄段猪均可感染猪链球菌病，但以3～12周龄猪，尤其断奶仔猪最易感［5］，该病已成为严重影响各国养猪业发展的一种重要疫病［6］。张九州等［7］根据GenBank登录的猪链球菌2型特异的荚膜多糖（cps2 H）基因序列作为检测靶标，在其序列的保守区域设计LAMP引物，利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增，优化了LAMP的反应条件和反应体系，并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示，该法对SS2进行扩增，扩增产物显色呈现阳性反应，电泳出现阶梯状条带，最低检测量为0.186fg/μL模板DNA，比常规PCR高1,000倍，且与其他常见的细菌无交叉反应。

2.3副猪嗜血杆菌检测

副猪嗜血杆菌（Hps）可引起猪的副猪嗜血杆菌病，该病以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征。近几年来，世界各地均有发生副猪嗜血杆菌病的报道，并且发病率呈上升的趋势，已经成为一个全球性的重要猪病［8］。随着我国规模化养猪业的不断发展，该病发作呈加速流行趋势并成为多病原呼吸道疾病综合征中的重要一员，危害日渐严重，对养猪业造成了巨大的经济损失。车勇良等［9］建立了Hps可视化LAMP检测方法，在55℃水浴1h即可对Hps核酸进行高效扩增，反应结束后加入SYBR Green Ⅰ即可通过肉眼观察对结果进行判断。该方法具有很强的特异性，其对DNA核酸的最低检测限为40fg，是常规PCR检测最低限的100倍，显示出较高的敏感性。

2.4猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检测

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）作为猪传染性胸膜肺炎的病原菌，可引起严重的传染性呼吸道疾病，该病具有高发病率和致死率，广泛分布于各国，主要感染生长育肥猪，可引起发烧、腹泻以及严重的呼吸窘迫。刘亚娟等［10］根据APP ApxIVA基因的保守区设计6条-LAMP引物，建立了APP的LAMP方法。结果显示，该法在64℃下反应15min，DNA即可出现扩增，扩增后2～3min内即可判定结果，最低检测限为0.307ng/L，具有良好的重复性及稳定性，与其他病原菌无交叉反应，同时，试验结果可实现肉眼可视化观察。

2.5猪多杀性巴氏杆菌检测

猪多杀性巴氏杆菌（Pm）为猪呼吸道综合征的主要病原之一，可原发或继发猪呼吸道综合征，降低饲料利用率，严重影响养猪业的经济效益。孙建华等［11］根据猪多杀性巴氏杆菌Plp B基因序列为靶基因设计特异性引物，建立了猪Pm特异性的LAMP快速检测方法。经反应条件优化，确定反应条件为63℃、20min。检测结果显示，建立的LAMP检测方法具有良好的特异性，灵敏度为25cfu/mL，与大肠杆菌、Hps、APP、沙门氏菌无任何交叉反应。

2.6金黄色葡萄球菌检测

金黄色葡萄球菌感染可造成猪的急性、亚急性或慢性乳腺炎，坏死性葡萄球菌皮炎及乳房的脓疱病。蔡克周等［12］以金黄色葡萄球菌（CMCC10201）的femA基因作为靶序列，设计LAMP和PCR引物，通过凝胶电泳，判断检测结果。对8株常见致病菌进行LAMP特异性试验，表明对金黄色葡萄球菌的检测具有很高的特异性，LAMP检测金黄色葡萄球菌的灵敏度为8.7cfu/mL，直接检测猪血中金黄色葡萄球菌的检出限为8.7×102cfu/mL，PCR法的检出限为8.7×103cfu/mL。

3　小结

LAMP技术作为一种快速基因扩增技术，自发明以来，在国内外疾病、卫生、食品及环境等多个领域都取得了重大成就，近年来受到了越来越多的关注，LAMP的整个过程均在恒温条件下进行，不需要昂贵的仪器设备，而易在基层部门普及的检测技术，避免了常规PCR对于温度循环的特殊要求所带来的各种不便，可快速、准确地做出传染性疾病病原学诊断，从而及时有效控制疫情，使养殖场损失降到最低。但LAMP检测技术同样存在一些不足：①LAMP对于引物设计要求很高，需要设计的引物数目多、结构复杂。②检测灵敏度太高，易因空气中的气溶胶污染而产生假阳性结果。③在LAMP扩增结果判定方面也存在一定的问题，当以琼脂糖凝胶电泳法法判定结果时，结果为梯形条带，不易鉴别非特异性扩增。当焦磷酸镁白色沉淀和体系中添加染料法判定结果时，可能存在因结果颜色不明显而造成肉眼观察不便捷及误判。另外，当有非特异扩增时，染料也可结合，影响结果判定。当微流控芯片和实时浊度仪法判定结果时，则需要购置昂贵的分析仪器，随着研究的不断深入，研究人员还将其原位杂交、免疫捕获、核酸杂交等技术进行联合，开发了很多有效的检测方法，尤其是将环介导恒温扩增与横向流动试纸条技术结合，将环介导等温扩增技术（LAMP）与横向流动试纸条（LFD）联合应用，建立一种新的病原快速检测技术，即LAMP-LFD技术，使得LAMP现场检测结果的观察更加方便、直观和准确。并解决了扩增产物形成气溶胶污染环境，导致样品间交叉污染的问题，开启了基因检测技术步入基层养殖场的应用新时代，极具推广前景。目前已经有科研人员在CSFV的检测方面［13］进行了一些探索，并取得了一定的成绩，笔者认为，LAMP-LFD技术将是未来LAMP检测技术将来的发展方向，在一些基层实验室和流行病学调查等领域具有广阔的应用前景。■

［1］ Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop- mediated isothermal amplifi cation of DNA［J］. Nucleic Acids Research， 2000，28（12）：63.

［2］ Nagamine K， Watanage K， Ohtsuka K， et al. Loop-mediated isothermal amplifi cation reaction using a nondenatured template［J］. Clin Chem，2001，47（9）：1742～1743.

［3］ Mori Y， Nagamine K， Tmita N， et al. Detection of Loop-mediated isothermal amplifi cation reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation［J］. Bioch and Bioph ResCom， 2001，289（1）：150～154.

［4］ 时建立，彭喆，郭立辉，等.猪霍乱沙门氏菌LAMP检测方法的建立与应用［J］.中国动物检疫，2015，32（8）：68～71，75.

［5］ Reams RY， Glickman LT， Harrington DD， et al. Streptococcus suis infection in swine： a retrospective study of 256 cases.PartⅡ.Clinical signs， gross and microscopic lesions， and coexisting microorganisms［J］. J Vet Diagn Invest， 1994，6（3）：326～334.

［6］ 江定丰，陈灵芝.猪链球菌2型感染猪和人的现状及研究进展［J］.动物医学进展，2008，29（5）：82～85.

［7］ 张九州，李欢，杨霞，等.猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立［J］.中国兽医科学，2012，42（4）：384～389.

［8］ 李凯年，逯德山.副猪嗜血杆菌病防治研究的新进展［J］.猪业科学，2007（12）：32～33.

［9］ 车勇良，陈如敬，王隆柏，等.副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法的建立与应用［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2013，41（12）：61～66.

［10］ 刘亚娟，聂福平，杨俊，等.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP方法的建立［J］.中国兽医学报，2016（2）：200～205.

［11］ 孙建华，蒋惠婷，朱玉欣，等.猪多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2014，36（12）：957～960.

［12］ 蔡克周，薛崇浪，张旻，等.环介导等温扩增检测猪血中金黄色葡萄球菌［J］.肉类研究，2012，26（11）：27～30.

［13］ 朱俊灵，叶佐东，邓洁汝，等.猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用［J］.华南农业大学学报，2016，37（1）：1～7.

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-011-14）；

山东省自然科学基金（ZR2012CQ012）；山东省技术创新项目（201220916006）。