袁锦雯 高珮芬 马珺茹 王怡琳 续苪 赵李祥

摘要：为了克隆AIDA-1基因并对其定序，通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1基因，通过酶切的方法克隆到pMD19-T simple载体中，再转化入感受态大肠杆菌，并通过基因测序的方法测定了AIDA-1的序列。 结果表明：成功克隆并测定了AIDA-1的序列，为蛋白展示、疫苗开发提供了重要的材料。

关键词：克隆； 测序； AIDA-1基因

中图分类号：Q36

文献标识码：A 文章编号：16749944（2016）08018401

1 引言

AIDA-1为革兰氏阳性菌的IV型分泌系统，可在革兰氏阴性菌表面形成桶装结构，展示其N-端携带的蛋白[1～3]。IV型分泌系统在革兰氏阴性菌表面展示外源蛋白的过程中，无需其他因子的辅助，因此是方便高效的细菌表面展示系统。该展示系统在疫苗的研制及表位筛选等方面具有很大的优势。本研究拟通过PCR方法，获取AIDA-1基因。

2 材料与方法

2.1 引物设计

根据NCBI上公布的AIDA-1的序列设计了上、下游引物。

2.2 PCR扩增

取1 mL对数生长期的大肠杆菌E393，煮沸10 min，12000 rpm离心2 min，取上清作为PCR模板[4～6]。PCR反应体系为50 μL其中包含：5 μL大肠杆菌模板，5 μL PCR反应缓冲液，1 μL dNTP，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，灭菌超纯水36 μL。将PCR反应混合液混匀后，通过如下程序进行PCR扩增：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min、 57 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min 共30个循环，72 ℃ 10 min， 4 ℃ 10 min。取20 μL的PCR产物，在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为80 V 50 min。

2.3 PCR产物的回收及连接

按照凝胶回收试剂盒说明回收AIDA-1产物。分别取4 μL PCR产物、1 μL pMD19-T simple载体及5 μL连接缓冲液，轻轻混匀后置于4 ℃连接过夜。

2.4 转化及序列测定

取10 μL连接产物，加入到100 μL新鲜的DH10B的感受态细菌中，轻轻混匀，冰浴30 min；在42 ℃水浴锅中热休克90s；立即加入800 μL的LB培养基，并轻轻混匀，置于37 ℃摇床中培养50 min。取400 μL培养物涂布于含有IPTG、V-gal及氨苄青霉素的LB平板中，37 ℃培养过夜。……