杨洋，徐萍，李潞，杜秋红，东洋，侯平

（1.沈阳医学院附属第二医院心内科，辽宁 沈阳 110002；2.辽宁中医药大学附属医院心内科）

疏血通注射液对急性心肌梗死大鼠组织miRNA-126表达水平的影响

杨洋1，徐萍1，李潞1，杜秋红1，东洋1，侯平2∗

（1.沈阳医学院附属第二医院心内科，辽宁 沈阳 110002；2.辽宁中医药大学附属医院心内科）

目的：观察急性心肌梗死后大鼠心肌组织miRNA-126表达水平的变化趋势以及疏血通注射液对急性心肌梗死大鼠心肌组织miRNA-126表达水平的影响。方法：选取SD大鼠80只，结扎大鼠冠状动脉前降支，建立心肌梗死模型，存活60只，随机分为疏血通组及模型组，另随机选取30只大鼠作为对照组。建模成功后，疏血通组给予疏血通注射液治疗，模型组及假手术组予以等量生理盐水，采用实时定量PCR检测术后不同时间大鼠心肌组织miRNA-126的表达水平变化。结果：术后第7天和第14天，疏血通组及模型组大鼠心肌组织miRNA-126表达水平较假手术组明显降低（P＜0.05），但2组间比较差异无统计学意义。术后第14天，疏血通组心肌组织miRNA-126表达水平较前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：miRNA-126在大鼠心肌梗死后7 d显著降低；随着时间的推移，miRNA-126表达水平逐渐升高；疏血通能够上调miRNA-126的表达水平。

疏血通；miRNA-126；大鼠；急性心肌梗死

［Abstract］Objective：To observe expression level change of miRNA-126 in the myocardial tissue of rats with myocardial infarction and to observe the influence of Shuxuetong injection.Methods：Myocardial infarction model was established in 80 SD rats，60 survival rats were randomly divided into Shuxuetong group and model group，the other 30 rats were randomly selected as control group.After the success of the modeling，Shuxuetong group received Shuxuetong injection treatment，model group and control group received same amount of normal saline.Real-time quantitative PCR was used to detect miRNA-126 expression levels in rat myocardial tissue at diferent time after operation.Results：After 7 days and 14 days，miRNA-126 expression levels in rats myocardial tissue in Shuxuetong group and model group were significantly lower than that in the control group（P＜0.05），but there was no difference between the two groups.After 14 days，miRNA-126 expression levels in the Shuxuetong group were higher than that after 7 days（P＜0.05）.Conclusions：miRNA-126 in 7 days after myocardial infarction significantly reduced.With the passing of time，miRNA-126 expression levels increased gradually and Shuxuetong can increase the expression levels of miRNA-126.

［Key words］Shuxuetong；miRNA-126；rats；acute myocardial infarction

急性心肌梗死（AMI）是指急性心肌缺血性坏死。据相关调查统计，每年有超过300万人患急性ST段抬高型心肌梗死［1］，且数量正逐年上升。寻找敏感性及特异性高的标志物及新的治疗靶点迫在眉睫。miRNA-126是一种内皮特异性miRNA，在人体内皮细胞中高度表达，并参与心血管疾病的发生、发展过程［2］。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组 选取SD大鼠80只，普通级，雌雄不限，体重220～300 g，3月龄，建立AMI模型，存活60只，随机分为疏血通组及模型组，另随机选取30只大鼠作为对照组。

1.2仪器与设备 称重仪：香山衡器（武汉市）有限公司；气管插管、医用输液器：Eppendorf公司；离心机（3K40）：湘潭离心机有限公司；PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽：日立高新技术（上海）国际贸易有限公司。

1.3实验方法

1.3.1建立大鼠AMI模型（1）大鼠称重后用2%戊巴比妥钠按60 mg/kg进行腹腔注射麻醉；（2）将大鼠固定于实验台上，按顺序连接心电图各个导联，描记体表心电图；（3）经口气管插管，连接小动物呼吸机，给予机械通气（呼吸比率 1∶1，频率65次/min，潮气量8 ml）；（4）开胸暴露出大鼠心脏，分离心包，结扎冠状动脉的前降支，建立AMI模型；（5）然后观察结扎部位心肌颜色的变化，如果颜色变白说明模型建立成功，同时可见心电图ST-T段明显抬高，此时记录心电图，关闭胸腔，缝合颈部皮肤，（6）各组大鼠在术前30 min和术后3 d连续肌注2.0×105U青霉素预防感染。

1.3.2大鼠建模后处理 建模成功后，疏血通组于造模后6 h按0.25 ml/kg给予疏血通注射液治疗，每天1次，连续用药14 d；模型组及对照组予以等量生理盐水，均于造模后6 h内经尾静脉注入，每天1次，连续用药14 d。

1.3.3制备病理标本 于术后第7天3组各随机抽取15只大鼠用断头法处死，（3组各剩余15只于术后第14天断头处死），处死后开胸取出心脏，分离出左心室，心肌组织变为灰白色的区域即为梗死灶，取少量梗死组织，用 10%甲醛固定后，进行石蜡包埋，制成4 μm切片，进行HE染色。

1.3.4实时荧光定量PCR检测miRNA-126的表达 采用Trizol试剂提取心脏组织标本的总RNA，并逆转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA），以此为模板进行 PCR扩增。使用Transgene公司提供的方法进行引物设计，采用实时荧光定量PCR法检测miR-126基因表达水平，以 U6基因作为内参。扩增 miR-126基因的上游引物：5＇-GGCATTACGTTTGGTACGCGAAA-3'；扩增U6基因上游引物：5'-CTCGCTTCAGCAGCACA-3'，反向引物皆为Takara提供的通用引物。扩增产物大小分别为70 bp和75 bp。以U6作为内参，采用2-ΔCt法计算目的基因的表达量，ΔCt=（Ct目的基因-Ct内参）。

1.4统计学方法 应用SPSS 17.0处理数据，计量资料以（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1AMI模型建立成功 大鼠体表心电图I、aVL等导联ST段呈弓背向上抬高，并且持续时间达30 min以上。术后对心电图进行对比观察，能够观察到心肌梗死后心电图ST-T的动态演变过程，见图1。

图1　大鼠AMI心电图动态演变过程

2.2心肌病理学检测结果 病理学染色可见心肌梗死组织变为灰白色，见图2。

图2　心肌病理学检测结果

2.3HE染色结果 HE染色结果显示，疏血通组心肌细胞排列有序，只有少量炎性细胞浸润，心肌纤维化相对模型组轻；模型组心肌组织可见大量炎性细胞浸润，心肌纤维化严重，与假手术组相比，大量正常的心肌组织被纤维组织代替，假手术组为正常心肌，见图3。

2.4实时荧光定量PCR结果 术后第7天，疏血通组大鼠及模型组大鼠心肌组织miRNA-126的表达水平较假手术组明显降低（P＜0.05）。术后第14天，疏血通组miRNA-126的表达水平较前明显升高（P＜0.05），模型组较前升高，但差异无统计学意义，2组与假手术组比较，仍低于假手术组（P＜0.05）。见表1。

表1　3组大鼠心肌组织miR-126表达水平比较

图3　心肌细胞HE染色结果（×200）

3　讨论

miRNA-126是一类高度保守的 miRNA，其定位点为Egfl7基因的第7内含子［3］，具有内皮特异性，因此它在血管内皮细胞中高度表达，参与炎症、介导血小板迁移等多种过程，在心血管疾病的发生、发展过程中起到重要调控作用［4］。疏血通注射液是水蛭和地龙经低温提取、膜分离等技术精制而成，其主要成分为水蛭素样物质和蚓激酶样物质。水蛭素是迄今为止发现的作用最强的凝血酶抑制剂，水蛭中还含有组胺样物质，入血后能迅速缓解血管痉挛，增加缺血组织的血供，缓解组织缺血缺氧的症状［5］。蚓激酶是一种纤溶酶原激活剂，具有抑制血栓形成、改善微循环和溶解血栓等作用，且其具有不易出血的优点［6］，已被广泛应用于AMI的治疗中。本研究通过检测AMI大鼠梗死心肌组织的miRNA-126表达水平变化及其随时间的变化，探讨miRNA-126与心肌梗死的关系，同时观察疏血通对AMI心肌组织纤维化的改善情况以及其对miRNA-126表达水平的影响。结果发现，当结扎冠状动脉前降支后，心电图ST段随时间成动态演变，处死大鼠后观察大鼠心肌梗死组织变成灰白色，经HE染色后，3组切片明显不同，正常心肌细胞排列有序，仅有少量炎细胞浸润；而模型组心肌细胞排列紊乱，心肌细胞严重纤维化，并有大量炎症细胞浸润；疏血通组大鼠心肌细胞排列紊乱程度及纤维化程度较模型组轻，炎症细胞浸润量较模型组低。提示疏血通注射液可改善心肌纤维化，减轻炎症反应，保护心肌细胞。实时定量PCR结果提示，在大鼠心肌梗死后第7天，疏血通组及模型组心肌组织中的miRNA-126表达水平显著低于假手术组，差异有统计学意义，说明miRNA-126表达水平下调与急性心肌梗死有关。术后第14天，疏血通组及模型组大鼠心肌组织miRNA-126表达水平低于假手术组，差异有统计学意义。但疏血通组与模型组比较，差异无统计学意义，可能与样本量小有关，这与李国达等［7］研究结果相似。

综上所述，结合病理图片及数据，本研究认为，在大鼠AMI组织中，miRNA-126表达水平在梗死后第7天下降，随着时间的推移，miRNA-126表达水平逐渐上调，miRNA-126具有保护血管内皮、促进血管再生等多重作用，疏血通注射液具有改善心肌纤维化及降低炎症反应等作用，其可促进miRNA-126表达水平的上调，但只有上升趋势，但差异无统计学意义，有待大样本研究。

［1］White HD，Chew DP.Acute myocardial infarction［J］.Lancet，2008，372（9638）：570-584.

［2］van Solingen C，Seghers L，Bijkerk R，et al.Antagomir-mediated silencing of endothelial cell specific microRNA-126 impairs ischemia-induced angiogenesis［J］.J Cell Mol Med，2009，13（8A）：1577-1585.

［3］Nagalla S，Shaw CK，Kong X，et al.Platelet microRNA-mRNA coexpression profiles correlate with platelet reactivity［J］.Blood，2011，117（19）：5189-5197.

［4］Lee Y，Ahn C，Han J，et al.The nuclear RNase IIl Drosh ainitiates microRNA processing［J］.Nature，2003，425（6956），415-419.

［5］张璇，肖兵，胡长林，等.疏血通注射液抗栓、溶栓作用机制的研究 ［J］.中国中药杂志，2005，30（24）：1950-1952.

［6］郭宏杰，张宪生.疏血通注射液对凝血功能的影响 ［J］.中国现代医学杂志，2007，17（19）：2380-2382.

［7］李国达，刘衍宇，方凌燕，等.miR-126及VEGF在大鼠心肌梗死交界区表达的动态变化 ［J］.心脏杂志，2015，27（6）：639-644.

The Influence of Shuxuetong Injection on the Expression Levels of miRNA-126 in Myocardial Tissues of Rats with Acute Myocardial Infarction

YANG Yang1，XU Ping1，LI Lu1，DU Qiuhong1，DONG Yang1，HOU Ping2∗
（1.Department of Cardiology，The Second Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110002，China；2.Department of Cardiology，The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine）

R542.2

A

1008-2344（2016）03-0146-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.03.006

2016-02-28

（吴迪 编辑）

沈阳市科技局计划项目（No.F14-182-1-00/F14-158-9-26）

侯平（1963—），女（汉），主任医师，教授，研究方向：冠心病、心律失常、心衰.E-mail：houping57@yahoo.com.cn