赵嘉惠　汪慧君　冯　程　尹菁华　林志淼　杨　勇

·论著·

痣样基底细胞癌综合征一例PTCH1基因突变研究

赵嘉惠汪慧君冯程尹菁华林志淼杨勇

目的： 检测一例痣样基底细胞癌综合征患者的PTCH1基因突变。方法： 收集患者临床资料，提取患者及其3位相关亲属（患者的父母及妹妹）外周血DNA，采用PCR扩增PTCH1基因编码区的全部外显子及其侧翼序列。同时以200名无关健康者外周血基因组DNA作对照。结果： 患者的PTCH1基因发生c.590G＞A杂合突变，导致氨基酸发生p.W197X改变。患者的父母、妹妹及200名健康对照未见该基因突变位点。结论： PTCH1基因p.W197X突变很可能是本例患者Gorlin综合征的病因。

痣样基底细胞癌综合征； PTCH1； 突变

痣样基底细胞癌综合征（nevoid basal cell carcinoma syndrome，NBCCS）又称Gorlin综合征，是一种罕见的常染色体显性遗传病［1］。NBCCS的发病率大约为1/57000，在儿童期及成人期均可发病。该疾病具有几乎完全外显率，主要临床表现为先天性发育异常和对某些肿瘤高度易感育异常，主要包括:过度生长、神经管闭合不全、骨的异常如分叉肋和多指畸形、颅内钙化等；相关肿瘤有基底细胞癌、牙源性角化囊肿成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤、脑膜瘤、卵巢癌、乳腺癌等，相关症状可多达100余种［2］。NBCCS的主要致病基因为编码Patched蛋白的PTCH1和PTCH2基因［3］。我们见到1例NBCCS患者，并通过Sanger测序检测PTCH1基因突变情况。

1　材料与方法

1.1材料 患者，女，31岁。以“双侧掌跖出现点状坑凹16年”就诊，无自觉症状，随年龄增长逐渐增多。该患者于22年前发现右上颌骨角化囊肿在当地医院行上颌骨囊肿刮除术。多年来间断反复出现上、下颌骨囊肿，多次行手术治疗。父母非近亲结婚，否认家族类似疾病史。体格检查:双侧掌跖可见针尖大小坑凹，无鳞屑或角化（图1a）。面型双侧不对称，左侧下颌骨升支可扪及明显膨隆感。右上肢正侧位片提示:右侧肱骨上段多发类圆型低密度区。上下颌骨CT扫描显示:上颌骨右侧磨牙区见低密度囊性病变，略成膨胀性生长。局部骨壁变薄，局部骨壁缺损且和右上骨壁相同，病灶内见牙齿。右上颌骨及左蝶骨窦见高密度影。下颌骨见正中和偏左侧见多个局限性骨质破坏，局部骨壁呈虫蚀样改变，局部呈膨胀性生长，其内骨质疏松（图1b）。口腔组织病理示:左、右上颌骨角化性囊肿。颅脑CT:脑镰处有钙化灶。下腹部B超提示子宫肌瘤，直径5.2 cm×4.9 cm左附件区囊肿，直径3.5 cm×2.9 cm。

1.2 方法

1.2.1DNA提取 本研究经北京大学第一医院伦理委员会批准，并向患者及其亲属充分说明，签署书面知情同意书。抽取患者及其3位家庭成员（患者的父母及妹妹）和200名该家系以外正常人外周血3 mL，2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，并采用天根公司血液基因组DNA提取试剂盒（DP319）提取外周血DNA。

1.2.2PCR引物设计 根据PTCH1基因序列（来源于ensemble网站，网址:http://asia.ensembl.org/index.html），利用NCBI Primer-BLAST在线版（网址: http://frodo.wimit.edu/primer3）设计23对特异性引物扩增患者PTCH1基因编码区23个外显子及其侧翼序列，引物由天一辉远生物科技有限公司合成（表1）。

图1　痣样基底细胞癌综合征患者掌侧皮损图及上下颌骨CT扫描图（图1a箭头指示皮肤点状凹陷，图1b箭头指示左下颌骨囊肿）

表1　PTCH1 1～23号外显子引物PCR扩增引物序列

1.2.3PCR扩增PTCH1目的基因反应体系及条件PCR反应体系25 μL，含基因组DNA 50 ng，dNTPs 0.4 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，上下游引物各为10 μmol/L，Tap DNA聚合酶2.5 U。反应条件:95℃预变性5 min后进行10个循环:94℃变性30 s，63℃退火30 s（每个循环后退火温度减少0.5℃），72℃延伸45 s，接着进行25个循环:94℃变性30 s，59℃退火45 s， 72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃延伸9 min。DNA扩增在Eppendorf Masercyler Gradient PCR扩增仪上进行。1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。所有PCR产物纯化后送至北京天一辉远生物科技有限公司测序部测序。

2　结果

以患者的基因组DNA为模板，所有23对引物（表1）在各自的条件下分别扩增出各自产物，包括所有外显子的编码序列以及两端至少60 bp的侧翼序列，产物经凝胶电泳后确认片段大小。所有产物纯化后测序结果与 Ensembl网站（http://www.ensembl. org）所公布的序列进行对照发现，患者的PTCH1基因4号外显子第590个核苷酸（从cDNA编码起始位点ATG算起）发生G→A杂合突变（c.590G＞A），导致编码氨基酸发生p.W197X改变，同时对父母的4号外显子进行验证，未发现该突变位点（图2a、b、c）。突变结果由反向测序得到验证，200名无关健康对照者DNA测序未发现相应突变。

图2　a、b、c痣样基底细胞癌综合征患者及父母PTCH1基因测序图（箭头指示基因突变位点）

3　讨论

NBCCS是一种罕见的常染色体显性遗传病，呈高外显率及差异表现度，其主要的发病机制为PTCH1基因突变后，导致其编码的Patched蛋白功能失活，从而引起其下游的Hedgehog信号通路的过度激活［4-6］。在Hedgehog信号转导系中，Patched蛋白为Hedgehog蛋白的受体［7］。正常情况下，PTCH1与Smo以无活性复合体形式存在。当PTCH1基因突变导致功能失活时，Smo可能始终处于激活状态，导致Hedgehog信号转导网络功能紊乱，下游靶基因被持续激活，从而参与肿瘤的发生［8-9］。

NBCCS患者在皮肤系统的主要临床表现是多发痣样基底细胞癌（50%～65%），及掌跖出现大量点状小凹（50%～87%）［10］。我们见到该例患者的掌跖部有点状凹陷NBCCS的特征性皮损。结合其他系统临床表现推测该病人可能为NBCCS患者，最终基因检测也证实了患者为PTCH1基因突变所致的NBCCS。部分患者出生时或儿童早期即可出现多发基底细胞癌（BCC），数目可多达1000个［11］，绝大多数患者肿瘤的侵袭性行为出现在青春期后这提示NBCCS的皮肤表现具有多样性。推测除了 PTCH1基因突变，BCC的发生可能还与其他肿瘤基因或Hedgehog信号通路调节基因的多态性，以及后天因素相关，如与长期日光及长期X线接触的部位可促使BCC的发生，长期摄入无机砷或者含砷较高的饮水、食物等可能发生此种肿瘤，在烧伤或其它瘢痕处也可能出现BCC［12］。本例患者经仔细皮肤科体检及皮肤镜检查未发现基底细胞癌皮损，但需要密切定期随访以监测基底细胞癌的发生，以及告知远离基底细胞癌的可疑诱发因素，如过度日晒等。

本研究采用分子生物学方法对该患者进行基因检测，发现该患者的PTCH1突变第197位氨基酸发生无义突变，该结果证实了该患者确患有NBCCS［3］。由于此类病人皮肤系统临床表现尚不显露可能出现误诊、漏诊，因此需提示医生注意进行鉴别诊断，掌跖部位的坑凹强烈提示NBCCS。部分患者可合并疣状表皮痣，若在体表发现，应及时去除防止恶变。而对于已经出现BCC的病人，可采用手术切除、电干燥、放疗、激光、冷冻、Mohs等多种方法进行治疗［13］。

迄今为止，PTCH1基因导致NBCCS共报道过113种突变，其中81%为错义或无义突变［14，15］。该病人的PTCH1基因存在p.W197X突变，未在The Human Gene Mutation Database（http://www.hgmd.cf.ac. uk/ac/all.php）基因库中出现，提示本例出现新发突变。该突变为无义突变，无义突变很可能导致编码蛋白质的mRNA出现大量降解（nonsense-mediated mRNA decay），从而致使该突变等位基因编码的蛋白明显降低。该突变由于出现提前终止的密码子从而导致截短蛋白，而截短蛋白通常被认为不具有野生型蛋白所具有的功能，但转录提早终止位置与NBCCS临床表现无明显关系［16］。我们通过基因诊断方法为该患者确诊疾病类型，并通过产前诊断避免该疾病在该患者后代中再次出现，对于指导临床诊断具有重要价值。由于本例患者未出现明显基底细胞癌样肿物，还需密切随访观察。

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PTCH1 gene mutation and nevoid basal cell carcinoma syndrome:a case report

ZHAO Jiahui，WANG Huijun，FENG Cheng，YIN Jinghua，LIN Zhimiao，YANG Yong.
Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China Corresponding author:LIN Zhimiao，E-mail:zhimiaolin@bjmu.edu.cn

Objective:To detect the PTCH1 gene mutation in a patient with nevoid basal cell carcinoma syndrome.Methods:Peripheral blood samples were collected from the patient，her family members，and 200 unrelated healthy controls.DNA was extracted from the blood samples，and subjected to PCR for the amplification of 23 encoding exons and their franking sequences of the PTCH1 gene，followed by DNA sequencing. Results:There was a heterozygous nonsense mutation of c.590G＞A in PTCH1 gene of the patient，resulting in the change of amino acid of p.W197X.This mutation was not detected in any of the family members and the 200 unrelated healthy controls.Conclusion:Heterozygous mutation p.W197X may be the underlying cause of the clinical phenotype of nevoid basal cell carcinoma syndrome in this patient.

nevoid basal cell carcinoma syndrome；PTCH1；mutation

北京科技新星计划B类（编号:Z151100000315044）

北京大学第一医院皮肤科，北京，100034

林志淼，E-mail:zhimiaolin@bjmu.edu.cn