王显艳　高峰　赵春明　孙玉荣　温秋婷　于秀文　张晓杰

1齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江　齐齐哈尔　161006

2齐齐哈尔医学院第三附属医院麻醉科，黑龙江　齐齐哈尔　161006

microRNA-140通过下调HDAC4抑制胃癌细胞迁移和侵袭能力△

王显艳1#高峰2赵春明1孙玉荣1温秋婷1于秀文1张晓杰1

1齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江齐齐哈尔161006

2齐齐哈尔医学院第三附属医院麻醉科，黑龙江齐齐哈尔161006

目的探讨microRNA-140（miR-140）对胃癌细胞SGC-7901迁移及侵袭能力的影响及其调控机制。方法将miR-140 mimics（miR-140）、miR-140特异性抑制剂（Anti-miR-140）和针对HDAC4的siRNA（HDAC4 siRNA）分别通过脂质体转染至细胞，应用实时荧光定量（qRT-PCR）检测细胞中miR-140和HDAC4 mRNA表达情况，并采用蛋白质印迹法（WB）分析HDAC4蛋白水平。采用Transwell小室模型分析miR-140上调和下调以及HDAC4调低对SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响。结果miR-140转染可使HDAC4蛋白表达降低，HDAC4 mRNA水平则无明显变化。miR-140上调与HDAC4调低均可显著抑制SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力，而在转染了Anti-miR-140的SGC-7901细胞中HDAC4蛋白表达增高，细胞迁移和侵袭能力增强。结论miR-140在转录后水平调控HDAC4表达。miR-140抑制胃癌细胞迁移和侵袭能力，部分是通过下调HDAC4而实现。miR-140可能作为肿瘤转移诊断及治疗的新靶点。

胃癌；microRNA-140；HDAC4；肿瘤迁移；肿瘤侵袭

Oncol Prog，2016，14（3）

胃癌是常见恶性肿瘤，在所有癌症死亡率中排名第二，严重危害人民的健康。抑制胃癌细胞发生侵袭转移是胃癌治疗整体水平提高的瓶颈。经过数十年不懈努力，众多学者从不同角度、不同方面对胃癌侵袭转移机制进行了大量的研究，取得了许多重大进展，但胃癌侵袭转移的具体作用机制到目前为止仍不清楚。因此彻底改善胃癌患者预后要从预防和治疗胃癌转移入手［1-2］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的内源性、单链非编码的RNA分子［3］。通过与靶基因mRNA碱基的3´端非编码区（3´-UTR）通过不完全或完全配对相结合，在转录后水平沉默靶基因从而参与细胞增殖、分化、代谢和凋亡等多种生物学过程。近年来越来越多的研究表明miRNA还可作为肿瘤癌基因或抑癌基因参与肿瘤的侵袭和转移过程［4］。

miR-140是一种在软骨增生和发育及骨关节炎发生过程中起重要作用的微小RNA［5-7］。但关于miR-140与肿瘤发生发展过程的关系研究很少。Iorio等［8］应用芯片技术筛选上皮源性卵巢癌与正常卵巢组织之间的miRNA表达差异，发现miR-140在卵巢癌中的表达水平显著降低。另有研究应用实时荧光定量（qRT-PCR）发现miR-140在神经胶质瘤由Ⅱ级到Ⅳ级的进展过程中表达增高［9］。但这两项研究均缺乏对miR-140在肿瘤发生发展中的作用机制研究。有研究形式miR-140在结肠癌中表达显著降低：miR-140可通过下调TGF-B信号通路中Smad3抑制结肠癌细胞增殖和转移能力［10］。Tuddenham等［11］在小鼠细胞中，应用荧光素报告系统得出的结果提示蛋白乙酰化酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）可能是miR-140的靶基因，miR-140通过抑制HDAC4表达来促进软骨细胞的发育。本研究以胃癌细胞SGC-7901为实验对象，通过体外实验，从上调和下调两个角度探讨miR-140对其迁移和侵袭能力的影响，并阐明可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

人胃癌细胞SGC-7901细胞系购自上海生命科学研究院细胞资源中心，于含10％小牛血清（FBS）的DMEM培养基（购自美国Gibco公司）中，在37℃、5％CO2培养箱中常规培养。转染试剂脂质体Oligofectamine和Lipofectamine 2000、TRIzol试剂、miR-140 mimics及其无关序列和miR-140 inhibitor及其无关序列均购自美国Invitrogen公司。HDAC4 siRNA购自上海吉凯基因化学有限公司。基质胶（Matrigel）为美国BD Bioscience公司产品。Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2实验方法

1.2.1miR-140上调实验分组①空白对照组（control）：仅加入Oligofectamine；②阴性对照组（negative control，NC）：加入miRNA mimics无关序列和Oligofectamine；③miR-140上调转染组（miR-140）：加入miR-140 mimics和Oligofectamine；④HDAC4 siRNA转染组（HDAC4 siRNA）：加入HDAC4 siRNA和Oligofectamine。转染前36 h，将2×105细胞/孔接种在6孔板中，待细胞长至30％～50％汇合时，参照Oligofectamine的说明书，将终浓度为100 nM的miR-140 mimics及其无关序列和HDAC4 siRNA分别转入细胞，转染后4 h加入20％FBS。

1.2.2miR-140下调实验分组①空白对照（control）：仅加入Lipofectamine 2000；②阴性对照（Anti-NC）：加入miRNA inhibitor无关序列和Lipofectamine 2000；③miR-140下调转染组（Anti-miR-140）：加入miR-140 inhibitor和Lipofectamine 2000。细胞接种方法同miR-140上调转染实验，参照Lipofectamine 2000的说明书，将终浓度为100 nM的miR-140 inhibitor及其无关序列分别转入细胞，转染后6 h加入20％FBS。

1.2.3qRT-PCR检测转染细胞内miR-140水平转染后24 h收集细胞，TRIzol试剂提取总RNA。以10 ng总RNA为模板，应用High Capacity cDNA synthesis kit反转录生成cDNA，以U6作为内参。qRT-PCR分析在美国Agilent公司ABl7000上进行。反应条件：95℃变性10 min；95℃15 s、60℃60 s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10 min，每个样本均做3个复管。qRT-PCR所用试剂盒和引物均购自美国Applied Biosystems公司。miR-140表达水平与其内参U6相比较后得到ΔCT，再与NC组相比，所得结果按2-ΔΔCT法计算，以相对表达量（relative quantity，RQ）表示。

考虑到不同国家(地区)的节假日以及各股票市场的停牌日期等不同而带来交易日上的差异，我们参考Hamao等(1990)的做法，剔除不完整数据及非同步交易数据，这也是学者们常用的一种处理方法，我们最终得到3341组观测值的收益率序列。

1.2.4qRT-PCR检测转染细胞内HDAC4 mRNA水平转染后24 h收集细胞并提取总RNA。以1 µg总RNA为模板按一步法RT-PCR试剂盒说明（日本TaKaRa公司）进行逆转录，采用带有ROX的Platinum SYBR Green PCR试剂盒（美国Invitrogen公司）检测HDAC4 mRNA的表达水平，以GAPDH作为内参。HDAC4和GAPDH的特异性引物均购自美国Invitrogen公司，HDAC4序列：上游5´-CCACAGUCUCUGUGUAAACCAC-3´，下游5´-GAUGGUAUCCAUUUUGGUGA-3´。qRT-PCR分析在美国Agilent公司ABl7000上进行。反应条件：50℃持续2 min，95℃变性2 min；95℃15 s、60℃30 s，共50个循环。每个样本均做3个复管。计算方式同上。

1.2.5蛋白质印迹法（western blot，WB）检测HDAC4蛋白表达细胞转染后48 h应用RIPA buffe（r购自北京碧云天生物技术研究所）提取总蛋白。将50 mg总蛋白经SDS-PAGE电泳后，转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。膜经封闭液作用后，与鼠抗HDAC4（1∶1000稀释，美国Santa Cruz公司）4℃孵育过夜。膜漂洗后加入羊抗鼠红外荧光二抗（1∶8000稀释，美国LI-COR公司）孵育40 min，利用红外荧光二抗成像系统（美国LI-COR公司产品）成像，采用Gel-Pro Analyzer软件分析目的蛋白表达水平。内参鼠抗GAPDH（1∶1000稀释），购自北京碧云天生物技术研究所。

1.2.6Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力转染后72 h提取总蛋白，应用WB检测HDAC4蛋白表达，验证转染成功后，通过Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力的变化。将60µl Matrigel（用无血清的DMEM培养液按1∶4稀释）铺于小室滤膜（孔径8µm）上，并轻轻晃动小室使胶均匀充分地分布在小室上室面，置37℃培养箱1 h凝胶。细胞饥饿24 h后重悬，调整浓度至1.5×106/ml，向上室内加入200µl的细胞悬液（细胞数3×105个），下室加入含10％FBS的DMEM完全培养液600µl，置于细胞培养箱中培养。24 h后取出小室，用棉签轻轻擦去位于上室的细胞，甲醇固定30 min，1％结晶紫染色15 min后，用PBS洗膜数次，直至将小室上多余的结晶紫染色洗去。置于倒置光学显微镜下观察，随机选取5个视野计数并拍照，阳性细胞被染成紫色。细胞迁移实验与侵袭实验相比，前者无需预先进行Matrigel包被，其余步骤同侵袭实验。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用两单独样本t检验，组间比较采用t检验及方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miR-140上调组miR-140的表达水平

胃癌细胞SGC-7901转染miR-140后24 h提取RNA，采用qRT-PCR方法检测miR-140表达水平。结果发现转染后的SGC-7901细胞中miR-140表达水平是NC组的1.89倍，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1　NC组和miR-140组的miR-140表达水平

胃癌SGC-7901细胞转染miR-140后48 h提取蛋白质，以control组和NC组作为阴性对照，HDAC4 siRNA作为阳性对照，通过WB检测HDAC4蛋白水平。结果显示，与两个阴性对照相比，miR-140表达上调可显著抑制HDAC4蛋白表达［control组（0.51±0.02），NC组（0.59±0.06），miR-140上调转染组（0.05±0.01），P＜0.05］，而与HDAC4 siRNA组（0.05±0.03）水平相当，见图2A。同时利用qRT-PCR方法检测了miR-140组中HDAC4 mRNA表达水平为（1.18±0.11），与NC组的（1.00±0.07）相比，差异无统计学意义（P＞0.05，图2B）。

图2　上调miR-140对HDAC4表达的影响

2.3miR-140下调对HDAC4蛋白表达的影响

miR-140 inhibitor转染后72 h提取蛋白质，采用WB检测miR-140下调对HDAC4蛋白表达的影响。结果显示，与control组（0.19±0.02）和Anti-NC组（0.24±0.04）相比，Anti-miR-140组（0.45±0.08）的HDAC4蛋白表达显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图3　miR-140下调对HDAC4蛋白表达的影响

2.4miR-140上调对胃癌细胞迁移及侵袭能力的影响（图4）

采用Transwell小室模型检测miR-140对SGC-7901细胞迁移能力的影响。结果显示，48 h后miR-140组、HDAC4 siRNA组穿膜细胞数分别为（68.2± 2.4）和（73.5±5.3），低于control组的（297.1±4.9）及NC组的（266.1±5.7），差异有统计学意义（P＜0.05，图4A）。采用Transwell小室侵袭实验检测miR-140上调对SGC-7901细胞侵袭能力的影响。结果显示，miR-140组、HDAC4 siRNA组穿膜细胞数分别为（109.5±7.4）和（108.8±3.6），低于control组的（303.1±5.1）及NC组的（482.6±8.4），差异有统计学意义（P＜0.05，图4B）。

2.5miR-140下调对SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响（图5）

Transwell小室模型法显示，24 h后Anti-miR-140组穿膜细胞数为（339.2±7.7），高于control组（127.2±3.1）及Anti-NC组（103.1±2.9），差异有统计学意义（P＜0.05，图5A）。Transwell小室侵袭实验结果显示，Anti-miR-140组穿膜细胞数为（291.2± 6.4），高于control组（102.7±4.4）及Anti-NC组（109.4±3.1），差异有统计学意义（P＜0.05，图5B）。

图4　miR-140上调对SGC-7901细胞迁移及侵袭能力的影响（结晶紫染色，×100）

图5　miR-140下调对SGC-7901细胞迁移及侵袭能力的影响（结晶紫染色，×100）

3　讨论

转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因，近年来的研究表明miRNA可作为肿瘤抑制基因或癌基因而参与肿瘤的发生及转移过程。有报道miR-15a、miR-16-1、miR-34a和miR-145等的缺失与慢性淋巴细胞性白血病、大肠癌、胃癌和乳腺癌等肿瘤的发生有关［12］，包括本研究在内的几个不同研究小组发现受抑癌基因p53调控的miR-192和miR-215的过表达，可导致肿瘤细胞的细胞周期阻滞，从而抑制肿瘤细胞增殖［9］，miR-192和miR-215下调与大肠癌和多发性骨髓瘤等的发生有关［10-15］。miR-21、miR-17-92 cluster和miR-221、miR-222等的过表达可促进大肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌等肿瘤的发生，miR-10b、miR-335、miR-373和miR-520c、miR-9及miR-21等的异常则与肿瘤转移密切相关［12-16］。这些研究结果表明miRNA的异常表达与肿瘤侵袭转移行为密切相关，miRNA可作为肿瘤转移的标志物，并可为肿瘤转移治疗提供候选靶点。

Song等［17］研究证实在结肠癌细胞HCT116和骨肉瘤细胞U-2 OS中miR-140在蛋白水平负调控HDAC4，并发现瞬时转染miR-140可导致HCT116 和U-2 OS细胞中细胞周期调控蛋白p53和p21过表达，从而引起细胞周期G1和G2期阻滞，结果显著抑制HCT116和U-2 OS细胞的增殖。

本研究将miR-140瞬时转染至人胃癌细胞SGC-7901中，通过Transwell小室实验发现转染后的SGC-7901细胞其迁移和侵袭能力显著下降，而转染了miR-140特异性抑制剂的SGC-7901细胞则表现出较强的迁移和侵袭能力，表明miR-140具有抑制胃癌细胞迁移和侵袭的作用。这与最近报道的miR-140可抑制肝癌细胞和非小细胞肺癌细胞增殖和转移能力的结果相一致［18-19］。

HDAC作为一种位于真核细胞中的蛋白酶，其主要功能就是修饰染色体的结构和调节其他功能蛋白，对肿瘤细胞生长、分化和凋亡过程均有调节作用，也可对基因表达起到指导作用。因此，HDAC是一个很有前景的癌症治疗方法，HDAC抑制剂已经成为当前研究人员热门研究对象。较为常用的HDAC抑制剂也用于临床肿瘤治疗，如果能对肿瘤中各种HDAC家族蛋白的表达情况做以研究，可以加强其抑制剂的研发和应用［20］。

本研究发现miR-140转染可下调SGC-7901细胞中HDAC4蛋白的表达，但其mRNA水平则无显著变化，表明miR-140是在转录后水平调控了HDAC4的表达，这与Tuddenham等［11］的报道相一致。本研究进一步地应用siRNA敲低HDAC4在SGC-7901细胞中的表达，与转染了miR-140的 SGC-7901细胞相比，两组细胞的迁移和侵袭能力都明显下降；当应用miR-140特异性抑制剂敲低miR-140后，则HDAC4表达增高，细胞的迁移和侵袭能力也显著增强。以上结果表明HDAC4确是miR-140的靶点，并且miR-140是在翻译水平下调HDAC4。同时表明miR-140抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力部分是通过下调HDAC4实现的。综上所述，本研究结果可为miR-140作为肿瘤转移诊断及治疗的靶点提供理论依据。

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MicroRNA-140 suppresses the migration and invasion potential of gastric cancer cell through downregulating HDAC4△

WANG Xian-yan1#GAO Feng2ZHAO Chun-ming1SUN Yu-rong1WEN Qiu-ting1YU Xiu-wen1ZHANG Xiao-jie1
1Department of Pathology，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China
2Department of Anesthesia，the Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China

ObjectiveTo investigate the role of microRNA-140（miR-140）in the migration and invasion potential of gastric cancer（GC）cell and the underlying mechanism.MethodmiR-140 mimics（miR-140），miR-140 specific inhibitor （anti-miR-140）or siRNA against HDAC4（HDAC4 siRNA）were transfected into human GC cell line SGC-7901 respectively using liposome.qRT-PCR was used to measure the expression levels of miR-140 and HDAC4 mRNA.HDAC4 protein was analyzed by Western blot.The in-vitro cell migration and invasion potential was determined by Transwell chamber assays after up-regulating or down-regulating miR-140 or knocking down HDAC4.ResultThe protein expression of HDAC4 was suppressed by miR-140 transfection without altering the target mRNA transcription level.The up-regulation of miR-140，andknock-down of HDAC4 by siRNA both inhibited the migration and invasion potential of SGC-7901 cells，down-regulation of miR-140 by the transfection of anti-miR-140 decreased the expression of HDAC4 protein，and enhanced the migration and invasion potential of SGC-7901 cells.ConclusionmiR-140 directly targets HDAC4 in the transcriptional level.miR-140 suppresses the migration and invasion potential of GC cell，at least partly through the downregulation of HDAC4.The findings of this study suggest that miR-140 may have a unique potential as a novel biomarker candidate for diagnosis and treatmentin tumor metastasis.

gastric cancer；microRNA-140；HDAC4；tumor migration；tumor invasion

R735.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.03.09

2015-12-10）

黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目（12531804）

（corresponding author），邮箱：wangxianyan1974@163.com