曾欣欣，毛先海，吴一飞，段小辉，彭宇明，秦 艳

（湖南师范大学第一附属医院 / 湖南省人民医院，长沙 410005）

慢病毒介导的RNA干扰沉默MLF1IP基在胆管癌RBE细胞中的表达

曾欣欣，毛先海，吴一飞，段小辉，彭宇明，秦 艳

（湖南师范大学第一附属医院 / 湖南省人民医院，长沙 410005）

目的：应用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默胆管癌RBE细胞中人髓细胞白血病因子1相互作用蛋白（MLF1IP）基因的表达，探讨其对胆管癌细胞体外增殖的影响。方法：设计合成针对MLF1IP靶基因序列的siRNA序列，进行重组慢病毒包装。与不含有MLF1IP基因siRNA序列的慢病毒分别转染胆管癌RBE细胞株。Real-time PCR检测MLF1IP基因的mRNA表达，MTT法检测细胞的增殖能力。结果：成功构建了MLF1IP-shRNA慢病毒质粒并进行慢病毒包装，Real-time PCR显示实验组MLF1IP基因的mRNA相对表达量为0.15±0.02明显高于对照组为1.01±0.12。MTT法检测实验组细胞的OD值对比对照组显著降低。结论：慢病毒介导的RNA干扰技术能有效沉默RBE细胞中MLF1IP基因的表达，并能明显抑制胆管癌细胞RBE的体外增殖能力。

MLF1IP；慢病毒；RNA干扰；胆管癌

胆管癌是胆道来源恶性肿瘤，约占消化道恶性肿瘤的3%［1］。起病隐匿，治疗效果不理想［2］，近年其发病率有逐年增加趋势。本课题组前期在胆管癌中对Fascin基因进行研究［3-4］，通过基因芯片筛查，发现人髓细胞白血病因子1相互作用蛋白（MLF1IP）基因有可能是其靶基因，目前对MLF1IP基因功能的研究较少，本文运用RNA干扰技术，沉默胆管癌RBE细胞中MLF1IP基因的表达，观察其对胆管癌细胞生长能力的影响，初步探讨MLF1IP基因在胆管癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 材料 人胆管癌RBE细胞株，293T细胞株、慢病毒载体pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0购自于吉凯基因技术有限公司；EcoR I 酶、Hpa I 酶、T4 DNA连接酶购自于NEB生物技术有限公司；M-MLV 逆转录酶、RNases抑制剂购自于Promega生物技术有限公司；Opti-MEM购自于Invitrogen生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MLF1IP-miRNA表达质粒的构建与鉴定 首先根据MLF1IP基因序列，利用Invitrogen网站，按照RNA干扰序列设计的原则，由吉凯基因技术有限公司设计合成针对MLF1IP基因的特异性干扰序列siRNA：5’-CAGGTATGAGCTATAATAA-3’。通过在Genebank数据库进行检索，确认设计的siRNA没有其它同源序列。然后通过退火配对产生双链的oligo，再通过双链两端所含EcoR I、Hpa I 酶酶切位点与双酶切后的慢病毒载体GV115进行特异性连接；将重组质粒转入制备好的感受态293T细胞，采用pGC-LV载体上的通用引物，通过RT-PCR方法挑选出PCR阳性菌落送生物公司进行DNA测序分析，通过测序对比，挑选出的正确克隆即为成功构建的MLF1IP-shRNA重组慢病毒载体，进行后续试验。

表1 双链DNA Oligo合成信息

1.2.2 慢病毒包装及滴度测定 根据Lipofectamine 2000的使用说明，将含有重组的慢病毒MLF1IPRNAi -pGC-LV载体与病毒包装辅助质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共感染293T细胞，以pGC-LV空白载体做为对照。转染后的48小时分别收集富含慢病毒的细胞的上清液。经离心后收集浓缩后的慢病毒。采用梯度滴定法测定病毒滴。

1.2.3 慢病毒转染RBE细胞及RT-PCR评估干扰效率 培养人胆管癌RBE细胞株，将其分为实验组（knock down；KD组）和对照组（Negative Control；NC组）。分别转染 MLF1IP-shRNA慢病毒载体和不含有MLF1IP基因siRNA序列的直接包装的阴性对照慢病毒载体。荧光显微镜下观察评估转染效率，RT-PCR方法检测mRNA的表达水平对干扰效果进行评价。用2-ΔΔCt数值分析法分析RT-PCR结果。

1.2.4 MTT法检测胆管癌细胞的增殖能力 分别取对数生长期的转染MLF1IP-shRNA 的RBE细胞（KD组）和转染shRNA阴性对照的RBE细胞（NC组），经处理后接种至96孔板中，每组设5个复孔，连续观察5天。分别在培养0、24、48、72、96、120小时后加入浓度为5g/ mL的MTT液，使用酶标仪检测每孔在490nm波长的吸光值（OD），计算5个复孔的平均OD值。 根据OD值计算各组细胞各时间点细胞计数值比该组第1天的细胞计数值的比值，获得该组细胞各时间点的增殖倍数，根据该增殖倍数和时间点，绘制基于细胞增殖倍数的生长曲线。对数据进行统计绘图。

1.3 统计学分析 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析处理。所有数据用均数±标准差表示，两个样本均数比较采用t检验，P＜0.05则认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MLF1IP-miRNA表达质粒的构建与鉴定 由于重组质粒可能发生基因突变，必须进行基因测序。测序结果结果表明，MLF1IP-shRNA 重组质粒序列与设计的DNA序列吻合，表明MLF1IP-shRNA寡核苷酸链重组成功（图1）。

图1 重组慢病毒质粒的基因测序结果

2.2 慢病毒包装及滴度测定 将含有MLF1IP重组病毒质粒及其辅助质粒共转染293T细胞，60h后荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光颗粒，细胞生长状态良好。可观察到细胞融合和合胞体现象，表明慢病毒包装成功。将浓缩后的病毒感染293T细胞。采用梯度滴定法进行病毒滴度测定，测得的病毒滴度为：3×108Tu/mL（图2）。

2.3 慢病毒转染RBE细胞及RT-PCR评估干扰效率 将实验组和对照组慢病毒载体分别转染人胆管癌RBE细胞株，72小时后均观察到有绿色荧光蛋白的表达（图3），感染效率可达到80%以上。应用RT-PCR方法检测两组细胞中MLF1IP mRNA的表达。实验组MLF1IP基因mRNA相对表达量为0.15±0.02，对照组为1.01±0.12。实验组明显低于对照组，差异有统计学意义（图4）（P=0.005）。其基因敲减效率为85%。表明ZMLF1IP-shRNA对RBE细胞的MLF1IP基因沉默有效。

图2 MLF1IP-RNAi重组慢病毒滴度测定（滴度从101到10-1稀释）（100×）

图3 慢病毒感染后的RBE细胞（400×）

图4 两组RBE细胞中MLF1IP mRNA的相对表达量（*，P=0.005＜0.01）

2.4 MTT检测细胞增殖能力 在处理后第1-5天分别提取两组细胞样本，检测细胞的OD值并计算平均值，根据各组细胞各时间点OD值比该组第1天的的比值。绘制基于细胞增殖倍数的生长曲线（图5）。从生长曲线分析，与对照组细胞相比，实验组的生长曲线走行平缓，细胞的总体生长速度明显降低，从第三天开始实验组比对照组细胞的增殖率均显著降低，差异有统计学意义。第五天实验组相对于对照组其抑制倍数为13.30倍。表明靶向抑制MLF1IP基因表达RBE细胞的增殖能力明显受到抑制。

图5 实验组和对照组RBE细胞的生长曲线

3 讨论

MLF1IP基因由Hanissian等［5］通过酵母双杂交的方法分离得到，全长75.8kb，由14个外显子组成。其cDNA包含1257bp的开放读码框、编码一个含有418个氨基酸，分子量为47KD的蛋白，他编码的蛋白包含两个双向的和两个经典的核定位信号，两个核受体结合基序（LXXLL），并在核内信号转导中起到受体结合蛋白的作用［6-8］，同时还包含两个亮氨酸拉链、两个富含脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸（PEST区域）的结构域和几个潜在的磷酸化位点可能对它出入细胞核起到调节作用。现有研究证实MLF1IP在有丝分裂的过程中发挥重要作用［9-11］。Hanissian等［12］应用免疫组化方法发现在胶质瘤中MLF1IP表达上调。同时在构建的大鼠胶质瘤模型上进一步证实，并且在肿瘤的核心上调最明显。张天佼等［13］通过RT-PCR方法研究发现MLF1IP基因在真性红细胞增多症患者的骨髓单个核细胞中表达显著上调。通过小鼠实验发现MLF1IP通过降低细胞周期过程中的抑制性效应，从而促进了早期红系前体细胞数量增加。表明MLF1IP促进了红系造血细胞的扩增而参与真性红细胞增多症的发生。

RNA干扰现象是一种由小分子双链RNA介导的在转录后水平特异性沉默同源靶基因的现象。在基因功能研究中被广泛应用［14-16］。慢病毒载体介导的RNA干扰因其具有安全性高、感染效率高、在细胞内可以较长时期稳定表达、并同时可以作用于非分裂像细胞，而成为RNA干扰实验最理想的工具。

本实验中我们通过选用GV115慢病毒载体系统，成功构建了MLF1IP-shRNA慢病毒质粒，经包装获得相应慢病毒，浓缩后的慢病毒经滴度测定为3×108TU/ mL，将重组慢病毒及阴性对照慢病毒分别感染RBE细胞，荧光显微镜观察感染效率达到80%以上。通过Real-time PCR检测两组细胞中MLF1IP mRNA的表达。实验组MLF1IP mRNA表达水平明显下降，显著低于对照组。其基因敲减效率达85%。表明重组质粒对MLF1IP基因进行了有效沉默，成功构建了MLF1IP稳定低表达的胆管癌细胞，为进一步研究MLF1IP基因的功能提供了工具。同时通过MTT实验证实MLF1IP基因沉默后，胆管癌RBE细胞的增殖能力明显受到抑制。以上结果表明MLF1IP基因可能与胆管癌的发生发展及侵袭转移相关，MLF1IP基因的功能及作用，值得进一步探讨。

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Lentivrus-mediated RNA interference of MLF1IP gene silencing in human cholangiocarcinoma cell line RBE

Zeng Xin-xin， Mao Xian-hai， Wu Yi-fei， Duan Xiao-hui， Peng Yu-ming， Qin Yan
（The First Affiliated Hospital of Hunan Normal University， The People＇s Hospital of Hunan Province， Changsha 410005， China）

Objective To observe the effect of lentivirus-mediated RNA interference （RNAi） of MLF1IP on the growth of human Cholangiocar cell line RBE in vitro， to investigate the role of MLF1IP in the pathogenesis. Methods Design for MLF1IP target gene sequence of siRNA sequence to construct the recombinant shuttle plasmid， shRNA， were transfected into 293T cell line of lentiviral packaging. Gulture of human bile duct carcinoma cell line RBE， divided into two groups， experimental group and control group. lentivirus vector were transfected into MLF1IP-shRNA and sHRNA negative control lentivirus vector.Detection of MLF1IP gene in PCR cells Real-time mRNA expression， to evaluate the jamming efficiency. MTT was used to detect the proliferation ability of bile duct cells in the experimental group and control group. Results A recombinant lentiviral vector expressing shRNA againsl MLF1IP gene was obtained and confirmed by DNA sequencing. The virus titer was 3x10^8 TU/mL. The Real-time PCR show that the experimental group MLF1IP gene mRNA relative expression was 0.15±0.02， in control group MLF1IP gene mRNA expression was 1.01±0.12. Compared with the negative control group， the expressions of MLF1IP mRNA significantly decreased in experimental group after the transfection of MLF1IP-shRNA lentiviral vector. MTT assay check OD value cells in the experimental group compared with the control group were significantly reduced. Conclusion Lectivirusmediated RNAi can effectively inhibit MLF1IP gene expression in RBE， and lead to cell proliferation inhibition.

MLF1IP； lentivirus； RNA interference； cholangiocarcinoma

R739.41

A

1673-016X（2016）02-0016-04

2015-10-20

毛先海，E-mail：mxhaiszy@yahoo.com