陆奕娜, 陈建伟， 张林田， 魏建华， 林 文

(汕头出入境检验检疫局,广东汕头 515031)

砷是一种广泛分布于自然界的元素，其生物毒性不仅与其含量有关，且更大程度上由其存在形态决定。常见的砷化合物有：亚砷酸(As(Ⅲ))、砷酸(As(Ⅴ))、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷胆碱(AsC)和砷甜菜碱(AsB)等。不同形态的砷化合物毒性差异很大，其毒性依次为As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MAA>DMA>AsC>AsB[1]。有机砷的毒性较小，砷糖是无毒的，无机砷的毒性最大。

近年来，随着现代仪器分析技术不断发展，砷形态分析取得了长足的进步，尤其是高效液相色谱(HPLC)与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用技术的应用，使得砷化合物得以不断被识别和确认。本文利用高效液相色谱和电感耦合等离子体质(HPLC-ICP-MS)谱联用技术，建立了同时快速测定虾类产品6种砷形态的分析方法，以期为虾类水产品的质量控制提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国，安捷伦公司)，配四元泵及自动进样器；Agilent 7700X电感耦合等离子体质谱仪(美国，安捷伦公司)；Hettich高速离心机(德国)；Milliplus 2150超纯水处理系统(美国)；Hamilton PRP-X100阴离子分析柱(250×4 mm，10 μm)。

砷标准物质：As(Ⅲ)(GBW0866)、As(Ⅴ)(GBW08667)、一甲基砷(MMA,GBW08668 )、二甲基砷(DMA,GBW 08669)、砷甜菜碱(AsB,GBW08670)、砷胆碱(AsC,GBW08671)，均购于国家标准物质研究中心，使用前用纯水配制成1 μg/mL储备液，0～5 ℃避光保存。(NH4)H2PO4、(NH4)2HPO4、NaH2PO4、NaAc、KNO3、NH4NO3、(NH4)2CO3、(NH4)HCO3、HAc、无水乙醇、甲酸、氨水均为分析纯；EDTA、甲醇为色谱纯。实验用水为超纯水。

1.2 仪器条件

1.2.1HPLC条件流动相A：0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1,V/V)(pH=8.5)，流动相B：50 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1,V/V)(pH=8.5)，流速1.0 mL/min，进样量15 μL，梯度程序：0～1 min，100%A～100%B；1～8 min，100%B；8～10 min，100%B～100%A；10～15 min，100%A。

1.2.2ICP-MS条件在分析测试前，先用10 μg/L的7Li、89Y、140Ce、205Ti调谐液对ICP-MS进行调谐，使89Y的灵敏度达到最优，同时也可使75As有较高的灵敏度和较低的检测限，优化后的条件：测质量数75As,m/z采集模式：TRA，采样周期：0.8 s，采集时间：9 005 s，载气:高纯液氩，雾化器：同心雾化器，等离子体气体流速：15.0 L/min，载气流速：1.0 L/min，辅助气流速：0.9 L/min。

1.3 样品处理

称取均质后的样品1.00 g于50 mL离心管中，加入38 mL 0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1，V/V)溶液，混均，超声萃取1.5 h，再加2 mL 3%乙酸，加水定容至50 mL，混均。于4 ℃冰箱中静止10 min后，上清液过0.22 μm滤膜于1.5 mL离心管中，以10 000 r/min离心15 min，吸取上清液进行HPLC-ICP-MS分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本实验对比了几种洗脱溶剂对6种砷形态的洗脱效果(表1)。结果显示，序号4、6、7、8色谱条件下，6种砷形态化合物基本洗脱分离。通过单标定性，6种化合物的洗脱顺序均为：AsC、AsB、As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)。序号8条件下，6种化合物的分离效果最好，在10 min内完全洗脱，除了As(Ⅲ)、DMA的保留时间比较接近外，其他几种化合物出峰间隔比较均匀。实验通过降低前期离子强度，即把流动相A：0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1)(pH=8.5)转向流动相B：50 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1)(pH=8.5)转换的时间延长，可以将As(Ⅲ)、DMA保留时间拉开，当其转换时间延长至1 min时，6种砷形态化合物的出峰间隔非常均匀，其保留时间分别为1.601、2.307、3.148、4.788、6.362、9.416 min，在10 min内洗脱完毕，色谱图如图1。本实验最终选定的色谱条件见1.2.1。

表1 液相色谱条件

图1 6种砷形态洗脱最佳色谱图Fig.1 The optimal chromatograms of six kinds of arsenic species

2.2 标准曲线及检出限

对浓度分别为0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 ng/mL的6种砷形态化合物混合标准溶液进行HPLC-ICP-MS分析，以峰面积(y)对浓度(x,μg/L)进行线性回归。结果表明，在该浓度范围内，6种砷形态的线性回归方程相关系数均在0.999以上。线性方程式及检出限见表2。

表2 6种砷形态的线性方程式及检出限

2.3 前处理的优化

分别采用甲醇-水(1∶l)、水、水-HAc(19∶1)、0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1) 等4种体系对养殖虾的6种砷形态进行提取，将上述处理完毕的上清液进HPLC-ICP-MS检测。实验同时采用文献方法[6]对养殖虾样品进行总砷测定，根据6种砷化合物含量总和与总砷含量的比率得到提取率。采用GB/T 5009.11-2003[7]对样品进行无机砷测定。实验过程添加6种砷化合物标准溶液，使得加标浓度为40 μg/kg。结果显示，四种前处理的提取率差别不大。0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1)作为提取剂获得的提取率及回收率相对较好，回收率符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[8]。因此，确定提取剂为0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1)。结果见表3。

表3 前处理砷形态化合物的结果及回收率(n=3)

ND:Not detected.

2.4 样品测定

用本法同时测定汕头市海域附近的养殖虾的6种砷形态，其检测结果见表4。养殖虾中的砷主要以砷甜菜碱(AsB)形式存在，基本不存在毒性较大的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)。

表4 养殖虾样品的6种砷形态化合物检测结果(n=3)

ND:not detected.

3 结论

建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱同时测定虾类中6种砷形态，优化了As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA、AsB和AsC 6种砷形态的分离条件，使6种不同形态的化合物在10 min内得以分离，基线平稳，各个化合物出峰相间隔均匀。该方法能快速地分析养殖虾中的6种砷形态。