刘长青， 廖秀芬， 陶慧林*， 孙 超， 徐 杰

(1.青海省有色地质矿产勘查局地质矿产勘查院测试中心,青海西宁 810006；2.桂林理工大学化学与生物工程学院,广西桂林 541004)

胰蛋白酶在脊椎动物中起消化作用，还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，是特异性最强的蛋白酶[1,2]，而且是决定蛋白质的氨基酸排列不可缺少的工具。此外，胰蛋白酶的测定对于研究胰腺的外分泌功能起着至关重要的作用[3]。在正常人的尿液中基本不含胰蛋白酶，但是在患有急性胰腺炎的病人的尿液中，胰蛋白酶的含量却很高(平均含量 84.4 μg/mL)[4]。因此，建立测定尿液中胰蛋酶的方法在临床诊断中具有重要意义。

目前，测定胰蛋白酶的方法主要有比色法[5,6]、色谱法[7]、电化学法[8]、荧光分析法[9,10]、化学发光法[11]、酶联免疫法[12]等。本文提出了利用异硫氰酸荧光素(FITC)-牛血清白蛋白(BSA)-Pb2+荧光探针测定胰蛋白酶的方法。实验表明，在表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(DBS)存在下，FITC-BSA-Pb2+发出较强的荧光，此时探针处于“打开”状态。而当加入胰蛋白酶后，FITC-BSA-Pb2+的荧光强度发生了相应的猝灭，探针被“关闭”。利用胰蛋白酶的浓度与FITC-BSA-Pb2+探针的荧光猝灭程度的线性关系，建立了一种测定尿液中胰蛋白酶的新方法。该方法灵敏度高，检出限低，线性范围宽，操作简单，对环境要求低。已经成功应用于实际样品的检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

RF-5301PC型荧光光度计(日本，岛津公司)；TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；pHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂)；FA1104电子分析天平(中国江苏泰兴市电子仪器厂)。

Pb2+储备溶液：200 μg/mL，使用时稀释至相应的浓度。异硫氰酸荧光素(FITC)，胰蛋白酶，牛血清蛋白(BSA)(国药集团化学试剂有限公司)，十二烷基苯磺酸钠(DBS)，Tris-HCl缓冲溶液。实验所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 FITC-BSA的合成

称取0.040 g FITC溶于10 mL的二甲亚砜(DMSO)中，另取0.067 g的BSA溶于10 mL pH=9.0的Na2CO3溶液中。然后分别吸取2.5 mL配制好的FITC溶液和BSA溶液于25 mL的比色管中，用pH=9.0的Na2CO3稀释至25 mL。将上述配好的溶液于温度4 ℃下避光反应24 h，装入处理好的透析袋中，用Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液透析24 h，再用水透析直至溶液呈无色为止。

1.3 检测方法

于一系列5 mL的比色管中，依次加入2.5 mL 1.0×10-6mol/L已合成的FITC-BSA，60 μL 2 μg/mL 的Pb2+溶液，20 μL 0.10 g/L的DBS溶液和一定量的胰蛋白酶，用pH=7.8的Tris-HCl缓冲溶液定容至刻度，摇匀。于温度40 ℃下反应5 min后，测定其相应的荧光强度。仪器的激发和发射荧光狭缝宽度均为5 nm。

2 结果与讨论

2.1 FITC-BSA的光谱特性

对所合成的BSA-FITC进行紫外-可见光谱和荧光光谱表征。由图1(A)可知，BSA的紫外吸收峰在278 nm(a)，FITC的吸收峰在489 nm(b)，而合成的BSA-FITC体系吸收峰在451 nm(c)。BSA-FITC探针的吸收峰位置与FITC、BSA都不一样，且吸收峰的峰形与峰高与FITC、BSA相比也发生了明显的变化。图1(B)为FITC、BSA溶液和FITC-BSA溶液的荧光光谱，由图1(B)可知，BSA的荧光光谱在350 nm处(a)，FITC的荧光光谱在460 nm处(b)，而FITC-BSA的荧光光谱在463 nm处(c)，且与FITC相比，FITC-BSA荧光光谱的半峰宽基本不变。以上结果证明，本实验成功合成了FITC-BSA荧光探针。

图1 (A)BSA(a)、FITC(b)和FITC-BSA(c)的紫外-可见吸收光谱；(B) BSA(a)、FTIC(b)和FITC-BSA(c)的荧光光谱Fig.1 (A) UV-Vis absorption spectra of BSA(a),FITC(b) and FITC-BSA(c)；(B) Fluorescence spectra of BSA(a),FITC(b) and BSA-FITC(c)

2.2 Pb2+及DBS对BSA-FITC体系荧光的增强作用

图2 Pb2+对FITC-BSA体系荧光强度的影响Fig.2 Effects of Pb2+ on the fluorescence intensity of FITC-BSA systema：FITC-BSA；b:FITC-BSA-Pb2+.

实验发现Pb2+溶液能有效增强FITC-BSA探针的荧光(图2)，使探针变得更灵敏。进一步考察了Pb2+溶液浓度对FITC-BSA体系的影响，结果表明加入60 μL的2 μg/mL的Pb2+时，探针的荧光强度达到最大。此外，表面活性剂可降低分子表面张力，形成胶束，缩短分子间距离，利于探针荧光的激发。因此考察了不同表面活性剂对体系的影响，实验表明加入20 μL 0.1 g/L的DBS时，体系的荧光强度大大增强。

因此，在后面实验中选择加入60 μL 2 μg/mL的Pb2+和20 μL 0.10 g/L的DBS，以增强探针的荧光，此时探针处于被“打开”状态。

2.3 胰蛋白酶对FITC-BSA-Pb2+探针的荧光“关闭”作用

分别考察了胰蛋白酶对FITC、FITC-BSA和FITC-BSA-Pb2+体系荧光强度的影响，结果如图3(A)所示。胰蛋白酶对FITC基本没有猝灭作用，对FITC-BSA体系有较大的荧光猝灭效果，然而在FITC-BSA-Pb2+体系中，胰蛋白酶可以灵敏地猝灭体系的荧光。用BSA修饰的FITC能被胰蛋白酶有效猝灭，可能是因为胰蛋白酶使合成物中BSA分解，FITC-BSA结构受到破坏，从而使体系的荧光发生猝灭。通过紫外-可见吸收光谱探讨了胰蛋白酶对FITC-BSA-Pb2+探针的荧光猝灭机理。由图3(B)可知，加入胰蛋白酶后，FITC-BSA-Pb2+探针的紫外吸收减弱，说明原来探针结构发生变化，结构受到破坏，验证了上述结论。根据文献报道[13]，在某些金属离子存在下，胰蛋白酶可以有效被活化。因此，在Pb2+存在下，体系的荧光能被胰蛋白酶有效猝灭可能是因为Pb2+能有效活化胰蛋白酶。

图3 (A) 胰蛋白酶对FITC、FITC-BSA和FITC-BSA-Pb2+荧光强度的影响；(B) 加入胰蛋白酶前(a)后(b)FITC-BSA-Pb2+紫外-可见吸收光谱Fig.3 (A) Effects of trypsin on the fluorescence intensity of FITC，FITC-BSA and FITC-BSA-Pb2+;(B) UV-Vis absorption spectra of FITC-BSA-Pb2+ before(a) and after(b) the addition of trypsin cFITC =5.0×10-7 mol /L,cPb2+ =0.24 μg/mL,ctrypsin=12 μg/mL.

2.4 实验条件的优化

为了获得最佳的荧光猝灭条件，实验考察了pH、缓冲介质、反应温度和反应时间等对体系的影响。因为胰蛋白酶存在人或动物体内，所处的pH环境在7～8之间，温度环境在30～40 ℃之间。因此考察了pH在7～8之间的缓冲液和30～40 ℃之间反应温度对FITC-BSA-Pb2+-胰蛋白酶体系的影响。实验结果表明，在pH=7.8的Tris-HCl缓冲液中胰蛋白酶对FITC-BSA-Pb2+探针的荧光猝灭值最大，体系在反应5 min内完成并且可以稳定1 h以上。

2.5 工作曲线

随着胰蛋白酶的加入，FITC-BSA-Pb2+探针的荧光被猝灭(图4(A))，FITC-BSA-Pb2+探针处于“关闭”的状态。在一定范围内，FITC-BSA-Pb2+体系的荧光猝灭程度与胰蛋白酶的量呈良好的线性关系。在最佳实验条件下绘制工作曲线，结果如图4(B)所示。胰蛋白酶的浓度在2.4～24 μg/mL范围内，体系的荧光猝灭值△IF与胰蛋白酶的浓度(c,mol /L)呈良好的线性关系。其线性回归方程为：△IF=13.3c+17.9，相关系数r=0.9972，用3σ/k方法计算得检出限为0.80 μg/mL。

图4 (A) 胰蛋白酶对FITC-BSA-Pb2+荧光的猝灭曲线;(B) 标准曲线 Fig.4 (A) Fluorescence quenched curves of FITC-BSA-Pb2+ system by trypsin;(B) The standard curve cFITC-BSA=5.0×10-7 mol/L;cPb2+=0.24 μg/mL.a-j:cTrypsin:0.0,2.4,4.8,7.2,9.6,12.0,14.4,16.8,19.2,21.6,24.0 μg/mL.

2.6 干扰实验

2.7 样品分析

采取新鲜尿液约20 mL于小烧杯中，静置0.5 h后，取上清液5.00 mL装入已处理好的透析袋，于水中透析24 h。按1.3的实验方法测定胰蛋白酶的含量，并进行加标回收实验。结果如表1所示。由表1可知，方法的回收率在102.1%～106.0%之间，相对标准偏差(RSD)≤ 3.0%(n=6)。以上结果表明所建立的新方法具有较高的准确度与精密度，可用于实际样品的分析。

表1 尿样分析结果

3 总结

本文合成了FITC-BSA荧光探针，并用Pb2+对探针进行增敏，实验发现FITC-BSA-Pb2+在DBS的存在下，可以发出较强的荧光。建立了利用FITC-BSA-Pb2+荧光探针测定胰蛋白酶的新方法。在温度30～40 ℃环境下，于pH=7.8的Tris-HCl缓冲溶液中加入胰蛋白酶后，FITC-BSA-Pb2+体系的荧光发生猝灭，且胰蛋白酶浓度与体系荧光猝灭的强度在2.4～24 μg/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数r=0.9972，检出限为0.80 μg/mL。该方法应用于尿液中胰蛋白酶的测定，结果表明所建立方法具有灵敏度高、选择性好、操作简单等特点，同时具有较高的准确度和精密度。在疾病的临床诊断中具有潜在的应用价值。