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高效液相色谱-荧光法同时测定人体尿液中的酪氨酸和色氨酸

2016-10-15杨永丽崔盼盼万益群

分析科学学报 2016年5期
关键词:尿样色谱分析健康人

杨永丽,崔盼盼,谭 婷,刘 翻,郭 岚,万益群*,

(1.南昌大学化学学院,江西南昌 330031;2.南昌大学分析测试中心,江西南昌 330047)

氨基酸在人体新陈代谢过程中起着重要的作用,是人体健康状况的重要参数。酪氨酸(Tyr )和色氨酸(Typ)是两种人体必不可少的氨基酸,它们是合成许多神经递质及其它多种重要化合物的前体物质,其代谢状况对人体有重要的病理及生理意义[1 - 4]。定量分析人体体液或组织中Tyr和Typ的含量不仅在蛋白质化学及评价食物营养价值方面意义重大,而且在多种疾病的基础研究和诊断治疗方面有重要的作用。目前,分离检测氨基酸含量的方法主要包括:离子交换色谱法[5,6]、衍生化气相色谱法[7,8]、毛细管电泳法[9 - 11]和柱前衍生-反相高效液相色谱法[12 - 15]等。在上述方法中,高效液相色谱法的样品前处理较为简单、灵敏度高、特异性好且能同时测定几种氨基酸,临床应用较为广泛。现有文献所报道的有关血清中Tyr和Typ分析研究的报道较多,但对人体尿液中Tyr和Typ含量同时测定的报道相对较少。

本文根据Tyr和Typ具有较强的自然荧光的特性,建立了高效液相色谱-荧光检测法测定健康人、普通病人及癌症患者尿样中Tyr和Typ的含量,取得了较为满意的结果。该方法操作简单,样品分析时间短,满足实际尿液分析要求,可为癌症的临床进一步研究提供一种新的技术手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国,Agilent公司),配有荧光检测器;Ohaus A P210电子分析天平(精确到0.01 mg);KQ-50DB型数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司);TDL-5-A 型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);Millipore-Q Gradient 超纯水装置(美国,Millipore公司)。

酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Typ)标准品均购自于美国Sigma公司。分别准确称取适量的Tyr和Typ标准品,置于2个25 mL的棕色容量瓶中,加入数滴1.0 mol/L NaOH溶液溶解,并用超纯水稀释至刻度,摇匀,配成100.0 μg/mL Tyr和127.0 μg/mL Typ的标准储备液,置于冰箱内4 ℃保存,使用时配成所需要的浓度。甲醇、乙腈为色谱纯;其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 色谱分析条件

色谱柱:Diamonsil C18柱(250×4.6 mm,5 μm);柱温为室温;流动相:水-乙腈(80∶20,V/V);流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL;荧光检测波长:λex=260 nm、λex=340 nm。

1.3 样品采集及前处理

健康人尿样由南昌大学志愿者提供;普通病人尿样由江西省中医院提供;癌症病人尿样由南昌大学第一附属医院提供。取供试者的晨尿2.0 mL左右,置于5 mL的塑料离心管中,然后以6 000 r/min离心10 min,取上清液过0.45 μm水相滤膜。取滤液1.0 mL定容于5 mL容量瓶中,进行色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 流动相的组成及流速的选择

分别采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸盐缓冲溶液(pH=6.56、7.0、7.43)作为流动相,考察了不同配比和流速下流动相对Tyr和Typ液相色谱分离行为的影响。结果表明:甲醇-水体系作流动相时,Tyr和Typ的分离度高,但两者保留时间显著延长;乙腈-磷酸盐缓冲液(pH=6.56、7.0、7.43)体系作流动相时,色谱峰保留时间有所缩短,但尿样中的杂质对测定产生一定干扰;当以乙腈-水=20∶80为流动相,流速为1.0 mL/min,荧光检测波长为λex=260 nm、λem=340 nm时,Tyr和Typ的色谱分离效果较好,具有较高的信号响应和合适的分析时间。因此,确定乙腈-水为流动相体系。Tyr和Typ色谱图见图1。

2.2 样品前处理方法的选择

人体尿液成分复杂,必须除去干扰Tyr和Typ检测的杂质,以保证分析结果的准确性。本文分别考察了以下三种尿样前处理方法:(1)取晨尿2.0 mL置于5 mL的塑料离心管中,以6 000 r/min离心10 min,取上清液过0.45 μm的水相滤膜。取滤液1.0 mL定容于5 mL容量瓶中,进行色谱分析。(2) 将采集的晨尿按体积比为10∶1的比例加入HCl,避光放置10 min,常温下以5 000 r/min离心5 min。取上清液6.0 mL,加入2.0 mL的30 g/L三氯乙酸充分混匀,以6 000 r/min离心10 min,取上清液1.34 mL,加入1.0 mL的碱中和,加水至5 mL后过0.45 μm的水相滤膜,进行色谱分析。(3)取晨尿1.0 mL置于5 mL的塑料离心管中,加2.0 mL乙腈,以6 000 r/min离心10 min,静置15 min,过0.45 μm的水相滤膜,定容至5 mL容量瓶中,进行色谱分析。

将空白尿样和添加Tyr和Typ标准溶液的尿样按上述三种方法处理,在已选定的色谱条件下进行分析,每个水平重复实验3次。结果发现:三种方法的平均回收率在83.7%~120.2%之间,均可满足实际样品的分析要求。但采用方法(3)处理测得的Tyr和Typ峰面积响应值均较低,这可能是由于采用乙腈作沉淀剂导致Tyr和Typ与蛋白质共沉淀;采用方法(2)测定的酪氨酸峰面积响应值较低,色氨酸的峰形较差且方法较为繁琐;而方法(1)操作简便,且Tyr和Typ的荧光响应强度较高,所以本实验采用方法(1)对尿样进行前处理。

2.3 干扰试验

实验考察了尿样中主要共存的无机物和有机物对1.0 μg/mL Tyr及Typ分析的影响。当相对误差在±5%范围内,共存物质的允许量(μg/mL)为:Mg2+(30),Ca2+(20),Cu2+(0.1),Fe3+(0.40),Mn2+(0.75),Zn2+(10),尿素(1 500),尿酸(15.1),葡萄糖、果糖、乳糖(108),肌酸(50),肌酐(100),尿卟啉(5.0),粪卟啉(6.0),5-羟色胺(4.0),5-羟吲哚乙酸(5.0),苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、脯氨酸(160),胆红素(5.0)。可见尿样中上述共存物质基本不会影响Tyr和Typ的测定。

2.4 标准曲线与检测限

取适量的Tyr和Typ标准储备液,配制成系列浓度的标准工作溶液,在选定的色谱条件下进行测定,以峰面积对浓度作图。Tyr和Typ的含量分别在0.10~6.0 μg/mL及0.05~6.0 μg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系,线性回归方程分别为:y=12.219x+0.6694(r=0.9991)和y=83.612x+6.7351(r=0.9993),以三倍信噪比计算,Tyr和Typ检测限分别是0.05 μg/mL和0.02 μg/mL。

2.5 回收率与精密度试验

取健康人和癌症患者尿样进行加标回收实验。分别添加三个不同水平的Tyr和Typ标准溶液,每个水平测定5次,结果见表1及表2。两种氨基酸的平均回收率在86.3%~122.3%之间,相对标准偏差(RSD)值小于8.51%,该方法可以满足实际样品的分析要求。

表1 健康人尿样加标回收率(n=5)

表2 癌症病人尿样加标回收率(n=5)

2.6 尿样分析

分别取一定量的健康人、普通病人和癌症患者的晨尿,按选定的样品前处理方法和色谱分析条件进行检测,每个尿样平行测定6次,尿样分析结果见表3。由表3可知:Tyr的水平在健康人、普通病人和癌症患者尿样中没有明显差异;Typ在健康人尿样中含量为4.774±0.093~30.532±0.061μg/mL,普通病人尿样中含量为8.122±0.486~27.504±0.298μg/mL;而癌症患者尿样中Typ水平各不相同,其中胃癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌和食管癌患者尿样中Typ的含量与健康人和普通病人相比总体偏低,其含量范围为2.188±0.071~5.289±0.998μg/mL,其他类型的癌症患者Typ的含量没有明显差异,这说明不同类型的癌症,Typ的代谢情况也会不同。

表3 尿样分析结果(n=6)

(续表3)

3 结论

本文建立了高效液相色谱-荧光检测法测定人体尿样中Tyr和Typ的分析方法,该方法样品前处理简便,应用于健康人、普通病人及癌症患者尿样分析,取得了较好效果。从样品分析结果可知,不同类型癌症患者尿样中Typ的水平会有差异,其中胃癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌和食管癌患者尿样中Typ的含量与健康人和普通病人相比总体偏低,Typ有可能是这些癌症的特异性标志物,有关这方面的研究将进一步报道。

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