江苏省连云港市药品检验所（222006）姜燕

附表1 梯度洗脱参数

附表2 养阴扶正胶囊样品中橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定结果

养阴扶正胶囊（苏药制字Z04000048）是由黄芪、白术、山药、石斛、陈皮、防风、天花粉七味中药组成的复方制剂，具有养阴清热，健脾益气的功效，用于呼吸道反复感染儿童及肺炎后期的治疗。陈皮和防风为方中两味主药，陈皮有效成分主要为橙皮苷，防风有效成分主要为升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷，因此对这两味药材的含量进行测定意义较大。为了保证临床用药的安全有效，本文采用RP-HPLC梯度洗脱、检测波长切换法对制剂中的橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量进行测定。

1 仪器与试药

Aglilent 1200高效液相色谱仪；Mettler Toledo AE240电子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-250DA型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司；橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号依次为110721-201316，111522-200607，111523-201509；纯度依次为95.3%，100%，100%），3批养阴扶正胶囊为医院自制（批号依次为20150421，20150506，20150526）。磷酸为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈为流动相A，0.2%磷酸为流动相B，梯度洗脱（见附表1）；流速：1.0ml·min-1；进样量：5μl；柱温：30℃；检测波长：256nm。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加甲醇制成每1ml各含0.12mg的溶液，分别精密量取3种对照品储备液各5ml，置20ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

附图 养阴扶正胶囊，HPLC色谱图。A 橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品（1. 升麻素苷，2. 橙皮苷，3. 5-O-甲基维斯阿米醇苷） B 养阴扶正胶囊试品 C 阴性对照溶液

2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，研细，取约4g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入石油醚60～90℃50ml，回流1h，弃去石油醚，精密加入甲醇50ml，称定重量，回流2h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液，即得。

2.4 专属性试验 取混合对照品溶液、供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪测定，记录色谱图，结果显示，理论板数按橙皮苷峰计算为9348，按升麻素苷峰计算为97833，按5-O-甲基维斯阿米醇苷峰计算为53498，养阴扶正胶囊样品色谱图中3种成分峰附近无明显杂质干扰，方法专属性良好。色谱图如附图。

2.5 线性关系考察 分别配制定量限浓度、含量测定的50%浓度、含量测定的80%浓度、含量测定的100%浓度和含量测定的120%浓度的溶液。每个浓度的溶液连续进样3次并记录图谱。以平均峰面积Y为纵坐标，对照品的浓度X（μg·ml-1）为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程：橙皮苷Y=5.9467X+0.6342，结果表明橙皮苷在0.5～144.8μg·ml-1范围内线性关系良好(r=0.9996)；升麻素苷Y=6.6378X+0.2398，结果表明升麻素苷在1.2～148.7μg·ml-1范围内线性关系良好(r=0.9994)；5-O-甲基维斯阿米醇苷Y=5.3053X+0.2241，结果表明5-O-甲基维斯阿米醇苷在2.3～138.3μg·ml-1范围内线性关系良好(r=0.9995)。

2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10μl，按照上述色谱条件连续进样6次，结果得橙皮苷峰面积的RSD为0.4%(n=6)，升麻素苷峰面积的RSD为0.2%(n=6)，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD为0.3%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取混合对照品溶液分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进样，记录色谱图，橙皮苷峰面积的RSD为0.5%，升麻素苷峰面积的RSD为0.4%，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD为0.4%，结果表明对照品溶液在24h内稳定。

取养阴扶正胶囊供试品溶液分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进样，记录色谱图，橙皮苷峰面积的RSD为0.4%，升麻素苷峰面积的RSD为0.7%，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD为0.6%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。

2.8 重复性试验 精密称取同一批号样品（批号：20150421），按供试品溶液制备方法平行制备6份，依次测定，计算得橙皮苷的平均含量为0.21%，结果的RSD为1.3%（n=6），升麻素苷的平均含量为0.12%，结果的RSD为1.6%（n=6），5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均含量为0.16%，结果的RSD为1.2%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取同一批样品（批号：20150421）（橙皮苷的含量为0.21%，升麻素苷的含量为0.12%，5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量为0.16%）5份，每份2g，精密称定。于5份样品中依次精密加入浓度为32.6μg·ml-1的橙皮苷对照品溶液、33.4μg·ml-1的升麻素苷对照品溶液、31.7μg·ml-1的5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液各1ml。照供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，按上述高效液相色谱条件测定，计算回收率。橙皮苷的平均回收率为102.1%，RSD=1.2%，升麻素苷的平均回收率为101.5%，RSD=1.4%，5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均回收率为100.5%，RSD=1.6%。

2.10 样品含量测定 取3批养阴扶正胶囊样品，按供试品溶液制备项下方法分别制成供试品溶液，精密吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，用外标法计算样品中橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，含量结果见附表2。

2.11 耐用性试验 精密称取同一批号的养阴扶正胶囊样品，按供试品溶液制备方法平行制备3份，考察4根不同商品规格的色谱柱Thermo C18(250mm×4.6mm，5μm)，Phenomenex C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，Agilent C18(250mm×4.6mm，5μm)，CAPCELL PAK C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，测定并计算样品中6-姜辣素的含量。结果显示，不同色谱柱对姜皮样品的含量测定结果无明显影响。

3 讨论

对含量测定供试品溶液制备方法进行考察：取同一批号样品依次考察不同提取溶剂，不同提取时间，不同提取方法的橙皮苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量。结果表明橙皮苷在回流提取时含量最高，超声提取结果不理想，不同提取方法杂质干扰均较大，因此采用石油醚回流进行预处理，减少杂质对含量测定的干扰。参照《中国药典》2010年版一部增补本中胆乐胶囊的提取方法，综合考虑含量和操作的简便性，最终选定回流提取方法。