江苏省启东市综合检验检测中心（226200）高建华

甘草黄酮属于一种具有较强活性的生物成分，目前其相应的提取分离技术正在高速的发展。本文通过建立并且检测甘草黄酮类有效成分的方法，为未来寻找更有效提取分离甘草黄酮化合物单一成分的方法提供一定的参考，为更好地利用甘草资源提供充分的依据。

1 实验仪器和实验试剂

1.1 主要实验仪器 HITACHI高效液相色谱仪（日本日立公司）；YCQ-300超声波清洗器（上海凯波超声仪器公司）；超纯水仪器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；AG135电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试剂 对照品：甘草素与异甘草素；色谱纯：甲醇（天津市永大化学试剂开发中心）；超纯水；分析纯：甲醇、乙腈、乙醇（95%）、冰醋酸等。

1.3 样品 甘草素样品（陕西中药研究所）

2 试验方法与结果分析

2.1 色谱条件 ①流动相：乙腈-冰醋酸（1∶4），进样量为20μl，流速为每分钟1.0ml。通过实验比较以下几种流动相：a甲醇一水(3∶7)；b乙睛一水(3∶7)；c乙睛一1.0%醋酸(l∶4)；d乙睛一0.5%醋酸(1∶4)等，结果表明，采用乙睛-0.5%冰醋酸(l∶4)作为流动相具有良好的分离效果，可予以使用。②色谱柱：YWGC18（250mm×4.6mm×10um） 采用YWGC18（250mm×4.6mm×10um）色谱柱进行对照，柱温度保持为室温水平，波长检测为276nm，根据色谱条件进行测定，样品甘草素成分分离度良好。

2.2 制备对照品溶液 采用高精度电子天平称取甘草素对照品，质量为10mg，放在50ml容量瓶内，首先加入甲醇进行稀释，时间为5分钟，然后继续加入流动相定容100毫升，充分摇匀。

2.3 制备供试品溶液 把供试品研细，选取粉末状的供试品进行精密的称定，大概0.2克，放在带塞的锥形瓶中，加入10毫升的乙醇（70%），摇匀，进行密封与称重，通过超声进行提取，时间为30分钟，控制超声温度在20度到32度之间。等待冷却后再次称重，如果失重则可以通过加入乙腈（20%）补足，使用微孔滤膜进行过滤即可取得过滤液0.5ml。半小提取样品完毕后应当在半小时到10小时以内进行测定。

2.4 检测波长的选择 吸取对照品储备液（0.6ml），放进10ml量瓶，使用流动相进行定容，波长范围在200～400nm，扫描测定结果显示：甘草素在276nm处有最大吸收，所以选定276nm为测定波长。

附表 对甘草素含量检测的回收率实验检测结果

2.5 方法学考察

2.5.1 线性分析 精密量取对照液，分别为0.5ml、1.0mL、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分置10mL量瓶中，加入20%乙腈流动相进行稀释直至量杯的刻度，再分别按照色谱条件进样20ul，记录峰面积值A，以峰面积A对浓度C进行线性回归。

甘草素对照品的线性关系以及范围如下：甘草素的回归方程：y=0.0050x－0.8000，R2=0.9991。标准曲线在检测范围内呈良好线性。

2.5.2 精密度试验 取出标准溶液20μg/ml，按照色谱的条件连续测试5次，记录每次的峰面积，计算其RSD为0.53%。通过测定显示，仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取适量供试品溶液，按照色谱的条件进行测定，测定的时间分别是0h、8h、12h、24h、36h，计算峰面积，RSD为1.5%。通过测定显示，供试品溶液可以在36小时以内保持稳定。

2.5.4 重复性试验 精密称取甘草样品，量为0.2g，一共5份，制备供试品溶液，进样20μl，使用面积外标法对甘草素与异甘草素含量进行测定，平均含量为2.5%，n=5，RSD=1.35%。

2.5.5 加样回收率实验 使用高精度电子天平称取样品0.2g，一共有5份，按照对照品溶液配制的方法进行配制，定容为50ml，摇匀，过滤。精密量取过滤液，量为5毫升，放在容量瓶（25ml），加入对照品溶液，定容，摇匀，进样，对峰面积进行记录。代入回归方程计算浓度C值，计算平均回收率。回收率在99%～108%，具有良好的准确性。如附表所示。

3 讨论

本研究表明，建立用高效液相色谱法测定甘草中甘草昔含量的方法，基于相同的色谱条件对甘草素样品的甘草素含量进行测定，具有良好的分离效果，当其浓度为4～60μg/ml的时候，具有良好的线性关系，平均回收率为101%，RSD为1.35%。

综上所述，高效液相法在检测甘草素与异甘草素含量中操作简单且应用效果良好，可以作为甘草素与异甘草素的质控标准。