不同金黄色葡萄球菌选择性分离平板效果比较及探讨

2016-10-14林碧莲

福建轻纺 2016年7期

关键词：葡萄球菌金黄色菌落

林碧莲

（福建省产品质量检验研究院，福建福州 350002）

不同金黄色葡萄球菌选择性分离平板效果比较及探讨

林碧莲

（福建省产品质量检验研究院，福建福州 350002）

针对GB 4789.10-2010中Baird-Parker平板对金黄色葡萄球菌特异性低，选择性弱等问题，文章引入金黄色葡萄球菌显色平板进行补充和改进，结果显示显色平板上金黄色葡萄球菌菌落形态典型，颜色特异，具有良好的特异性和较强的抗干扰能力。定量比对结果显示Baird-Parker平板与显色平板上金黄色葡萄球菌数值无显著性差异，将显色平板应用于金黄色葡萄球菌的定量检测具有良好的适用性和较高的可行性。

金黄色葡萄球菌；Baird-Parker平板；金黄色葡萄球菌显色培养基

金黄色葡萄球菌是人类常见的食源性致病菌之一，产毒菌株可引起食物中毒，历年来在我国各个省市食源性致病菌监测中金黄色葡萄球菌的检出率排名居高不下[1-3]。现有的检测方法很多，但只有传统的培养法被广泛认可，其检测过程依据标准GB4789.10-2010[4]进行，其中以Baird-Parker平板作为定量分离培养基，但其存有很多缺陷，蔡芷荷等[5]发现其它葡萄球菌如缓慢葡萄球菌，赛氏葡萄球菌在Baird-Parker平板的菌落特征跟金黄色葡萄球菌很相似，同样为黑色菌落，有浑浊带和明显的透明圈；赵薇等在进行金黄色葡萄球定量检测能力验证时，采用显色平板计数的结果为Baird-Parker平板的两倍，更接近目标值[6]，说明Baird-Parker平板在杂菌多的情况下可能存在特异性差，灵敏度低等问题，这些严重影响了金黄色葡萄球菌的分离率，给日常检测判读带来很大的难度。

因此亟需引进性能更好的培养基以更有针对性的高效定量分离金黄色葡萄球菌。目前，金黄色葡萄球菌显色培养基因其具有较高的特异性和灵敏度而得到相关检验技术者的青睐，其通过抑制一些杂菌，并能使目标菌形成特定的颜色或形态而被有效锁定。国内学者对其进行了深入的研究，主要比较分析Baird-Parker平板和各种显色平板的特异性，各平板对金黄色葡萄球菌的灵敏度，以及实际样品检测数据差异的显著性等[6-9]，但对于掺杂菌的定量比对的报道较少，也未见有对金黄色葡萄球菌显色平板进行相关的质量验收程序的报道，因此文章率先应CNAS-CL09：2013质量要求[10]，开展商业化显色平板的质控验收，并测试3种培养基对混杂菌中金黄色葡萄球的灵敏度，比对测试结果以确定显色培养基作为金黄色葡萄球菌的定量计数平板的适用性和可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

表1 混合菌液在3种平板的菌落总数及目标菌的检出情况

实验用菌株均来自于美国模式培养物集存库，编号分别为金黄色葡萄球菌：ATCC25923、表面葡萄球菌：ATCC1222、大肠埃希氏菌：ATCC25922、单核细胞增生李斯特氏菌：ATCC19115、粪肠球菌：ATCC29212；所用的平板计数琼脂（PCA）、营养琼脂（NA）、血平板、金黄色葡萄球菌显色培养基购于广东环凯微生物科技有限公司；Baird-Parker琼脂、脑心浸出液培养液购于北京陆桥技术股份有限公司；法国科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基购于郑州博赛生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基的质量验收

参照GB 4789.28-2013[11]的商品化培养基质量控制中Baird-Parker平板的验收方法以及广东环凯显色培养基产品说明书中质控说明，将金黄色葡萄球菌、表面葡萄球菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的新鲜培养液分别接种于Baird-Parker平板和环凯、科玛嘉两种显色培养基平板，培养后观察菌落形态、特异性并计算目标菌株（金黄色葡萄球菌）和阴性菌株（大肠埃希氏菌）的G值。

1.2.2 培养基的灵敏度检测

将上述5株菌的新鲜培养物分别用生理盐水制成菌悬液，并通过预实验（PCA平板菌落计数）确定菌浓度并适当稀释至约1000 CFU.mL-1，后各取1 mL菌液混合，补充生理盐水至10 mL，按照GB 4789.10-2010[4]第二法进行显色平板Baird-Parker平板的涂布及后续的确证实验，所得的菌落数值用于后期的比较分析。

2 结果

2.1 菌落形态特征

金黄色葡萄球菌在广东环凯显色培养基上的菌落为紫红色，菌落直径大于科玛嘉显色培养基的菌落，科玛嘉显色培养基上的菌落为粉色至淡紫色，Baird-Parker平板上菌落黑色，圆润，周围有浑浊带和明显的透明圈。

表面葡萄球菌在环凯、科玛嘉两种显色平板微弱生长，呈半透明、乳白色的小菌落，在Baird-Parker平板上菌落呈黑色，有浑浊带及细小的透明圈。单核细胞增生李斯特氏菌在两种显色平板均为蓝绿色菌落，生长良好，在Baird-Parker平板上生长良好，菌落黑色，无浑浊带和透明圈。粪肠球菌在显色平板上为蓝绿色菌落，生长微弱，在Baird-Parker平板上生长良好，菌落为黑色，无浑浊带和透明圈。

2.2 培养基的质量验收及特异性验证结果

金黄色葡萄球菌在环凯、科玛嘉显色平板和Baird-Parker平板3种培养基上均生长良好，G值分别为10.5、9、11.5；大肠埃希氏菌在3种培养基上都不生长，G值都等于0，都达到GB 4789.28-2013商品化分离平板目标菌的质控要求（目标菌株G值＞6，阴性菌株＜1）。

2.3 培养基灵敏度的测试结果

表1显示了混合菌液在环凯、科玛嘉显色平板和Baird-Parker平板3种平板的菌落数及目标菌数，其中Baird-Parker平板上的菌落总数明显大于显色平板，类似的，疑似目标菌数Baird-Parker平板也明显高于显色平板。但是，经过确证实验，3种平板的目标菌数的平均值分别为87，89，90(单位都为CFU.mL-1)，无显著性差异。

3 分析与讨论

Baird-Parker平板含有的氯化锂和亚碲酸钾能抑制大多数非葡萄球菌类杂菌的生长。金黄色葡萄球菌代谢产生的卵磷脂酶和脂肪酶，能分解卵黄使得菌落周围形成浑浊沉淀环和透明圈，同时由于亚碲酸钾被还原而使菌落呈黑色。此次试验中单核细胞增生李斯特氏菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌在Baird-Parker平板都为黑色菌落，表皮葡萄球菌有浑浊带和透明圈、与目标菌颜色形态相似具有干扰作用；显色平板中特定的显色底物能使目标菌菌落显现特定的颜色，而干扰菌被抑制或不产生特征性颜色，使目标菌直观易于挑取和计数，金黄色葡萄球菌显色平板上金黄色葡萄球菌菌落呈粉红色或紫红色，表面葡萄球菌呈细小的乳白色菌落，单核细胞增生李斯特氏菌和粪肠球菌为蓝绿色菌落，各种菌的菌落特征明显，特异性强，易于金黄色葡萄球菌的有效锁定。

从混合菌液中筛选金黄色葡萄球菌，两种显色平板的菌落总数(约380 CFU/mL)明显低于Baird-Parke平板（486 CFU/mL），说明显色平板对杂菌的抑制效果更好，抗杂菌干扰性的能力更强。可疑菌落数的比较（Baird-Parker平板平均值113 CFU/mL，显色平板平均值分别为87 CFU/mL,89 CFU/mL）也说明这一问题；最后3种培养基确认的目标菌数据平行性好，检测结果无显著差异，说明显色培养具有较高的适用性。国内外相关学者的报道也证实这一点，报道中指出在实际样品检验中，显色平板检测性能优于Baird-Parker平板[5-9，12]。此外，研究结果显示2种显色平板都符合GB 4789.28-2013的商品化培养基验收要求。所以，将金黄色葡萄球菌显色平板应用于金黄色葡萄球菌的定量检测具有良好的可行性，在国家标准未修改前，建议引进此显色培养基作为GB 4789.10-2010中金黄色葡萄球菌检测的辅助手段。

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[4] GB 4789.10-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验[S].

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[11] GB 4789.28-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求[S].

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