刘小丽，朱梦晴， 蔡雯洁， 刘亚男， 石亚男， 屈长青*

（阜阳师范学院 a.生命科学学院；b.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心 安徽 阜阳 236037）

白术根茎的总RNA提取方法的比较

刘小丽a，b，朱梦晴a， 蔡雯洁a， 刘亚男a， 石亚男a， 屈长青a，b*

（阜阳师范学院 a.生命科学学院；b.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心 安徽 阜阳 236037）

探讨提取白术根茎总RNA的最优方案。以新鲜白术的根茎为实验材料，采用三种方法提取其根茎总RNA。用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品完整性，用RT-PCR方法验证RNA质量。用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的方法，获得了完整性最好、质量最高的总RNA样品。提取白术根茎总RNA的三种方法中，多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的方法最理想。

白术根茎；RNA提取；完整性；RT-PCR；琼脂糖凝胶电泳。

白术（Atractylodes macrocephala）为菊科多年生的草本植物，喜凉爽，怕高温高湿［1］。《中国药典》记录了白术是温性药材，根茎入药，味甘浓、苦、微辛，具有和中益气、祛湿健脾、敛汗固表、预防流产、增食欲、消痰等功效［2］。可用于肌肉消瘦、面色苍白、自汗水肿、慢性腹泻、胎气不安等症状［3］。国内外目前对白术的研究主要集中于化学成分、药理及栽培方面，而对白术的分子方面的研究甚少。

在分子研究中，经常需要提取高质量的RNA样品。白术的成分有挥发性物质（含有苯酚等芳香类化合物）、内酯类、多糖类、糖苷类以及氨基酸等。多糖的许多理化性质与RNA很相似，沉淀RNA时会产生富含多糖的凝胶状沉淀。这种含有多糖的沉淀难溶于水。在去除多糖时候RNA也容易被去除，从而造成RNA产量的减少。另外，由于挥发性成分中的酚类物质的影响，RNA会变得粘稠，而难以分离［4］。所以，在白术根茎的总RNA提取过程中，多糖和挥发性成分可能会影响RNA提取的纯度及产率。本文通过不同方法提取白术根茎总RNA，以找到其最佳方法，为进一步开展白术的分子生物学研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1白术幼苗

由抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心提供。

1.1.2试剂

TRⅠzol试剂（美国Ⅰnvitrogen公司），通用植物总RNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），焦碳酸二乙酯（DEPC），氯仿，异戊醇，去离子水，琼脂糖，三羟甲基氨基甲烷（tris），冰乙酸，乙二胺四乙酸（EDTA），溴化乙锭（EB）溶液，及其他常规试剂。

1.1.3主要仪器设备

精密电子天平（AR224CN），海尔低温保存箱，恒温水浴锅，高压灭菌锅（HVE-50），高速冷冻离心机，超净工作台，梯度PCR仪（BⅠO-RAD），通用电泳仪，电泳槽，超微量紫外可见分光光度计（BⅠODRPDUO），凝胶成像分析仪（BⅠO-Pro），等。

1.2方法

1.2.1白术根茎的总RNA提取

称取新鲜白术根茎100～200 mg，洗净后用吸水纸吸干水分。用剪刀剪成小段，再用锡箔纸把样品包好，放入液氮速冻，暂时不用的材料在-80℃下保存。

1.2.1.1植物总RNA提取法

植物总RNA提取法简称TRⅠzol法。取速冻的白术根茎100 mg，按照TRⅠzol试剂提供的使用说明进行总RNA的提取。

用20 uLDEPC处理水溶解RNA样品。最后取3 uL处理后的样品用于1%琼脂糖凝胶电泳，其余的在-80℃保存［5］。

1.2.1.2多糖多酚植物总RNA提取试剂盒方法

多糖多酚植物总RNA提取试剂盒方法简称多糖多酚法。称取100 mg新鲜的白术根茎，在液氮中研磨后，加1 mL TRⅠzol和38 uL沉淀剂A，震荡混匀。其余步骤按照试剂盒说明书操作。

1.2.1.3通用植物总RNA提取试剂盒方法

通用植物总RNA提取试剂盒方法简称通用植物法。称取新鲜白术根茎100 mg于液氮中研磨，然后转移样品到1.5 mL RNase free离心管中，按照试剂盒说明书操作。

1.2.2RNA质量检测

1.2.2.1RNA浓度与纯度的紫外吸收检测

取上述RNA样品各1 uL，加99 uL RNase free water，混匀。用超微量紫外可见分光光度计测定样品浓度，及紫外吸收比值（A260/A280）。

1.2.2.2琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

取上述样品各3 uL，分别与2 uL 6×loading buffer、1 uL EB（10 mg/mL）混合，加入1%琼脂糖凝胶中进行电泳。电压150 v，15 min后取出胶块，放入紫外凝胶图像分析仪中观察条带。

1.2.2.3RT-PCR验证RNA质量

分别对上述三种方法提取的RNA样品做RT-PCR，以检测其是否可用于后续实验。

第一链cDNA的合成：采用反转录试剂盒，取2 uLtotal RNA，依次加入1 uL Oligo（dT）18，10 uL 2×TS Reaction Mix，1 uL Trans Script RT，用RNase free water补齐至 20 uL。42℃孵育 30 min，85℃加热5 min失活Trans Script RT。在冰盒中冰浴5 min，然后短暂离心，于-20℃中保存。PCR反应总体系：模板2 uL

Primer1 0.5 uL

Primer2 0.5 uL

2×Master Mix 6.25 uL

ddH2O 3.25 uL

扩增片断为白术内参基因Actin（登录号KF465783），上游引物为：5'-TCTCTTTATGCCAGTGGTCG-3'，下游引物为：5'-TCCTTGCTCATCCTGTCAG-3'。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。目的片断长度527 bp。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃30 s；55℃30 s；72℃1 min；72℃延伸10 min；4℃保温2 h。最后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物［6］。

2　结果与分析

2.1不同提取方法得到的总RNA样品的产量和纯度

用不同提取方法得到的总RNA质量如表1所示。可以看出，用多糖多酚法提取的RNA产量最高，但是紫外吸收比值（A260/A280）2.16略高，可能有降解；用TRⅠzol法提取的RNA产量最低，且紫外吸收比值（A260/A280）小于1.8，说明有蛋白质、多糖等污染，纯度较差；通用植物法提取的RNA产量略低，但紫外吸收比值（A260/A280）是2.06，质量较好［7］。

表1 白术根茎总RNA样品的紫外吸收结果

2.2总RNA样品的琼脂糖凝胶电泳结果

图1为三种方法提取的总RNA样品的1%琼脂糖凝胶电泳结果。第一泳道为TRⅠzol法提取的RNA，第二泳道为用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取的RNA，第三泳道为用通用植物总RNA提取试剂盒提取的RNA。三个泳道中，第二泳道条带最亮，说明产物量最高，与上述浓度检测结果一致。28S条带与18S条带的宽度和亮度都接近2：1，略有弥散，说明产物少量降解。TRⅠzol法提取的RNA样品，条带亮度较弱，浓度较低。28S条带与18S条带的宽度和亮度几乎相等，说明样品有明显降解。通用植物法提取的RNA条带亮度最弱，浓度最低，与紫外检测结果吻合。28S条带与18S条带的宽度和亮度接近，表明RNA有降解［8，9］。另外，从电泳图上看，条带上方有大量拖尾，表明有大分子物质残留。电泳结果初步表明，多糖多酚法提取的总RNA样品，产量最高，质量最好。但是能否用于后续实验，还需要进一步验证。

2.3RT-PCR结果

为了验证上面的结果，我们对上述三个样品做了RT-PCR实验，用三种方法提取的RNA样品分别为模板，进行反转录。根据白术内参基因Actin（GenBank登录号 KF465783）设计引物进行PCR，结果如图2。从图中可以看出，模板2扩增条带单一、清晰，产物量多，扩增效果好。模板1看不到条带，几乎没有扩增产物，表明模板不可用。模板3虽然扩增到了目的条带，而且产物量也很多，但是扩增有杂带，可能是样品中存在基因组DNA，效果不好。相比之下，模板2的扩增效果最好。多糖多酚法提取的RNA样品可用于后续分子实验。

图1　白术根茎总RNA样品的琼脂糖凝胶电泳图

图2　RT-PCR产物电泳图。（M：DNAMarker；

3　讨论与结论

在RT-PCR等分子生物学实验中，获得高质量的模板非常重要，而提取高质量的RNA是合成高质量模板的前提和基础。但白术等药用植物根部含有大量多糖、多酚、蛋白质等次生代谢物，不利于RNA的分离纯化，提取RNA的难度增大，能否有效去除这些物质是提取高质量RNA的关键［10］。若要保证RNA提取的纯度，就必须尽量减少样品中的多糖多酚成分。

植物总RNA提取（TRⅠzol法）是比较传统的RNA提取方法，操作简单、耗时比较短，但提取过程中RNA容易降解。马艺沔等［11］用TRⅠzol法提取丹参根部RNA，有污染，同时也有降解现象。李滢等［12］用通用植物总RNA提取试剂盒所提取的丹参根部RNA得率低、难以消除基因组DNA的污染。与本实验的情况类似。多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法提取的RNA，质量好、纯度高。RT-PCR能扩增出目的条带，说明此法提取的RNA可以用于后续其他实验［7］。

总之，本文所探究的提取白术根茎总RNA的三种方法中，以多糖多酚植物RNA提取试剂盒法得到的RNA的质量最高，用于后续实验的效果最好。多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的方法最理想。

［1］ 石俊英，陈随清，崔亚军，等.中药鉴定学［M］.北京：中国医药科技出版社，2006：193.

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Comparison of extraction methods of total RNA from rhizome of Atractylodes macrocephala

LⅠU Xiao-lia，b，ZHU Meng-qinga，CAⅠWen-jiea，LⅠU Ya-nana，SHⅠYa-nana，QU Chang-qinga，b*

（a.School of Life Sciences；b.Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine of Anhui Province，Fuyang Normal University，Fuyang Anhui 236037，China）

Objective：to investigate the best way to extract total RNA from fresh rhizome of Atractylodes macrocephala. Method：taken fresh rhizome of A.macrocephal as material，the total RNAwas extracted with three methods.We detected the integrity of total RNA samples，using ultraviolet spectrophotometry and agarose gel electrophoresis，and RT-PCR method for testing the quality of total RNA samples.Result：the analysis of agarose gel electrophoresis and RT-PCR amplification showed that，RNA sample of the highest quality and the best integrity was obtained by the method of polysaccharide polyphenol plant total RNA extraction kit.Conclusion：the method of polysaccharide and polyphenols plant total RNA extraction kit was the best among the three kinds of extraction methods of RNAfrom fresh rhizome ofA.macrocephala.

Atractylodes macrocephala rhizome；RNAextraction；integrity；RT-PCR；agarose gel electrophoresis

Q812

A

1004-4329（2016）01-046-04

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2016）01-046-04

2015-09-30

安徽省教育厅自然科学研究项目（KJ2013B200）；大学生创新创业训练计划项目（AH201310371044，201510371059）；阜阳师范学院学生科研项目（fsyxsc201439）资助。

刘小丽（1967-），女，博士，副教授，研究方向：生药学。

屈长青（1972-），男，博士，教授，研究方向：天然产物。Email：qucq518@163.com。