韩　燕，管清梅，邹　影

（1.阜阳师范学院 化学与材料工程学院，安徽 阜阳 236037；2.安徽环境污染物降解与监测省级实验室，安徽 阜阳 236037）

牛奶中氯霉素残留的高效液相色谱法测定

韩燕1，2，管清梅1，2，邹影1，2

（1.阜阳师范学院 化学与材料工程学院，安徽 阜阳 236037；2.安徽环境污染物降解与监测省级实验室，安徽 阜阳 236037）

利用液液萃取-高效液相色谱-二极管阵列检测方法建立了牛奶中氯霉素残留的分析方法。牛奶样品加入冰醋酸和饱和氯化钠溶液后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩并转溶于乙腈中，用正己烷脱脂，最后浓缩定容于流动相中，进行仪器分析。氯霉素浓度在20～1 000 ng/mL范围内线性良好，方法的加标回收率在86.5%～94.4%之间，最低检测限为2 ng/mL。

氯霉素；兽药残留；牛奶；高效液相色谱

氯霉素（Chloramphenicol，简称CAP）作为一种广谱的抗生素，能抑制细菌蛋白质的合成，广泛用于各种细菌性疾病的治疗，特别是奶牛乳腺炎的治疗，从而易使奶及奶制品中容易产生氯霉素残留。由于氯霉素有严重的副作用，能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症等疾病［1］，因此对人类的健康构成了潜在威胁，欧盟、美国、日本等许多国家都禁止在动物饲养过程中使用氯霉素，为此建立了各种方法来监测牛奶中氯霉素的残留，并且规定牛奶中不可检出氯霉素。

牛奶中氯霉素残留的测定方法主要有气相色谱法［2］、液相色谱法［3-7］、气质联用法［8，9］和液质联用法［10-16］，通过文献［2-16］比较可知，气相色谱-电子捕俘获检测器（GC-ECD）的检测灵敏度最高，方法检测限可低至0.1 ng/mL，但其样品预处理繁琐，萃取后必须进一步衍生化。气质联用法（GC/MS）和液质联用法（LC/MS）对仪器和操作者能力要求较高。高效液相色谱法虽然灵敏度低，但其预处理相对简单，具有分离速度快、效率高和操作可自动化等特点。此外还有放射免疫法［17］和酶联免疫分析法［18，19］，Arnold［17］报道了在奶中氯霉素的放射免疫的痕量分析方法，奶中氯霉素残留在1 ng/mL以上的能被准确定量，回收率高于95%，但放射免疫法具有同位素半衰期短、存在放射性污染及仪器设备复杂等缺点。另外荷兰推出了测定氯霉素残留的酶联免疫测定试剂盒Quik2card（现又称La cart test试剂盒）。该方法在应用时，样品不经过预处理时的检出限量为5～10 ng/mL，经过预处理及浓缩后的检出限可达1 ng/mL以下［18］，但样品在被判断为阳性时，需用质谱方法做最终确认。

因此本文采用高效液相色谱法建立了牛奶中氯霉素残留的分析方法，并对本地出售的鲜牛奶和消毒牛奶中氯霉素残留进行了检测。

1　实验方法

1.1仪器

高效液相色谱仪：Agilent 1100 Series配有二极管阵列（DAD）检测器（Agilent，USA）；离心机LD4-2型（北京医用离心机厂）；快速混匀器SK-1型（金坛市富华仪器有限公司）；超声波清洗器B-52型（BRANSON仪器公司，USA）；旋转蒸发仪RE52-A型（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2药品与试剂

试剂（除注明外，均为色谱纯）：乙酸乙酯；乙腈；正己烷；甲醇；冰醋酸（分析纯）；氯化钠（分析纯）。

市售纯牛奶（品牌：光明、长富、蒙牛、夏进、伊利）；氯霉素标准品（纯度≥99.99%，1 000 μg/mL，配于乙酸乙酯中，由广东省佛山市顺德区农产品质量检验监督中心提供）。

氯霉素标准储备液：准确移取 1 mL 1 000 g/mL的氯霉素标准品于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成100 μg/mL储备液，置于-20℃冰箱中保存。

氯霉素标准中间溶液：准确移取1 mL 100 μg/mL的氯霉素储备液氮气吹干，用甲醇-水（35∶65，V/V）定容至10 mL，配制成10 μg/mL中间溶液，置于4℃冰箱中保存。

氯霉素标准工作溶液：分别准确移取适量中间溶液，用甲醇-水（35：65，V/V）配制成20、50、100、250、500、1 000 ng/mL的标准工作溶液，置于4℃冰箱中保存。

1.3检测方法

1.3.1液相色谱条件色谱柱

Waters Spherisorb ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：35：65的甲醇-水溶液；流速：1 mL/ min；进样量：50 μL；二极管阵列检测器：狭缝16 nm，扫描范围190～600 nm。

1.3.2样品提取方法

吸取10 mL牛奶于离心管内，加入150 μL冰醋酸和1 mL氯化钠饱和溶液，漩涡10 s，加入20 mL乙酸乙酯，充分振荡3 min，离心，吸取上层清液于浓缩管中，重复萃取两次，合并乙酸乙酯层，55℃下氮气吹干。油状残渣用5 mL乙腈溶解，漩涡15 s，将溶液转移至60 mL分液漏斗中，加入10 mL正己烷振荡2 min，弃去正己烷，重复操作一次，下层溶液在氮气下吹干，用甲醇-水（35：65，V/V）溶解残渣并定容至1 mL，用0.45 μm水性滤膜过滤后待测定。

1.3.3全程空白实验

不加牛奶，其余同1.3.2方法处理，按1.3.1的色谱条件进行检测。

1.3.4加标回收率检测

分别量取10 mL牛奶样品于离心管中，分别移取0.1 mL浓度为0.5、1、5、10 μg/mL的标准工作溶液与上述离心管中，获得氯霉素添加水平分别为5、10、50、100 ng/mL的加标样品，漩涡10 s，放置10 min，同2.2和2.3方法操作。每种加标浓度分别做四个平行样。

1.3.5牛奶样品的检测

按照1.3.1-13.4的实验方法分别对光明、长富、蒙牛、夏进和伊利五种品牌的牛奶进行检测和回收率测定。

2　结果与讨论

2.1校正曲线与方法检测限

将浓度分别为 20、50、100、250、500、1 000 ng/mL的氯霉素标准系列，依次进样，以氯霉素峰面积值为纵坐标，标样浓度为横坐标绘制标准曲线，见图1。可知，氯霉素标准曲线线性范围为20～1 000 ng/mL，回归方程式为

y=0.090 6x-0.366，

其相关系数R2为0.999 9。以基线噪声3倍峰面积对应的氯霉素的含量作为检出限的规则（RSN=3），得到氯霉素的检出限为2 ng/mL。

图1　氯霉素标准曲线

2.2回收率实验

分别在牛奶（光明牌）中加入一定浓度的氯霉素后，按1.3.4实验方法测定其方法回收率，结果见表1。

表1　牛奶中氯霉素的加标回收率

2.3全程空白与牛奶样品的检测结果

全程空白样品中未检出有氯霉素残留，结果见表2，氯霉素标准、样品和样品加标的液相色谱图见图2。

图2　氯霉素标准、牛奶样品和添加氯霉素标准的牛奶样品色谱图。A：氯霉素标准，1 μg/mL；

表2　部分国产品牌牛奶中氯霉素

4　结论

与固相萃取净化［7，20］和基质固相分散［21］等样品前处理方法相比较，本方法样品前处理简单实用、回收率高、重现性好，可作为牛奶中氯霉素残留的检测方法。本方法回收率较高，不同浓度加标回收率的值均在86.5%～94.4%之间，且具有较好的精密度，说明本方法用于牛奶中氯霉素残留的检测能够取得可信的结果。

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HPLC determination of chloramphenicol residues in milk

HAN Yan1，2，GUAN Qing-mei1，2，ZOU Ying1，2

（1.School of Chemistry and Materials Engineering，Fuyang Normal University，Fuyang Anhui 236037，China；2.Anhui Provincial Key Laboratory for Degradation and Monitoring of the Pollution of the Environment，Fuyang Anhui 236037，China）

The liquid-liquid extraction-high performance liquid chromatography-diode array detection method were used to establish the analytic methods of chloramphenicol residues in milk.After the milk samples was added glacial acetic acid and a saturated sodium chloride solution，extracted with ethyl acetate，the extract was concentrated and dissolved in acetonitrile and transferred with hexane，and finally concentrated to volume in the mobile phase for instrumental analysis.Chloramphenicol concentration was excellent in 20～1 000 ng/mL linear range，and the recovery method was between 86.5%～94.4%，and the lowest detection limit was 2 ng/mL.

Chloramphenicol；veterinary drug residues；milk；HPLC

O623.731

A

1004-4329（2016）01-037-04

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2016）01-037-04

2015-07-20

安徽高校省级自然科学研究一般项目（2015KJ010）；安徽高校省级自然科学研究一般项目（2014KJ010，2014KJ014）；阜阳师范学院科研机构校级委托专项课题（2015HJJC02）；阜阳师范学院自然科学研究项目（2015FSKJ06）资助。

韩燕（1977-），女，硕士，讲师，研究方向：环境化学。