王　刚，陆超锋，单乐天，应航，2（.浙江中医药大学第一临床学院，浙江杭州30053；2.浙江省中医院，浙江杭州30006）

实验研究

右归饮及其拆方防治大鼠膝骨性关节炎的实验研究

王刚1，陆超锋1，单乐天1，应航1，2
（1.浙江中医药大学第一临床学院，浙江杭州310053；2.浙江省中医院，浙江杭州310006）

［目的］探讨右归饮及其拆方（温补肾阳方、温益精血方、温肾益血方）对SD大鼠膝骨性关节炎影像学表现、组织病理学及关节液中的白细胞介素-1β（IL-1β）表达的影响。［方法］取体重为150±20 g SD雄性大鼠108只，随机分成正常对照组、右归饮组、温补肾阳方组、温益精血方组、温肾益血方组及模型组各18只，用碘乙酸注射液注射大鼠膝关节腔制备膝关节骨性关节炎动物模型。分别于灌胃给药4、8、12周后分批对6组大鼠进行取材并对大鼠的食欲、体重、步态、精神状况、毛发色泽、呼吸、心率，影像学X线表现，HE染色的病理切片以及关节液中IL-1β的含量进行检测。［结果］造模后大鼠均出现精神萎靡、食欲不振、双膝肿胀，行动不利、反应迟钝等，在治疗4周、8周、12周后，右归饮组X线表现与模型组相比，膝关节关节软骨轻度变薄，关节间隙无明显狭窄，轻度骨赘等；组织病理学与模型组相比，右归饮组关节软骨面比较完整，无坏死、溃疡，骨小梁结构、形态完整等；关节液中的IL-1β的含量模型组明显高于正常对照组（P<0.05），与模型组相比，右归饮组、温补肾阳方组、温益精血方组、温肾益血方组关节液中的IL-1β含量下降（P<0.05）；右归饮组与其拆方组比较关节液中的IL-1β含量明显下降（P<0.05）。［结论］右归饮以及其拆方在一定程度上均可缓解SD大鼠膝骨性关节炎关节软骨的损伤，且随着疗程的延长右归饮缓解关节软骨损伤作用更加显著,从而起到防治骨性关节炎的作用。

右归饮；膝骨性关节炎；拆方；白细胞介素-1β；

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是以软骨退行性变和继发骨质增生为主的慢性退行性骨关节病。KOA以患者膝关节疼痛、肿胀、僵硬以及活动受限为主要临床特点，严重时甚至致残［1］，对患者的生活质量造成严重的影响。老年人是该病好发的人群，其中以女性最为多见，但成年人发病的比例也不断上升，有关统计显示，成年人患有膝关节骨性关节炎的比例为6%［2］。现代医学至今对KOA的确切病因及发病机理尚未完全明了［3］，目前认为KOA的病因可能与关节形态、骨密度、损伤、年龄、性别、种族因素、肥胖、营养以及生物力学等因素有关。至于KOA的治疗，西医还没有有效的药物能够修复关节软骨和逆转病理损伤，而我国传统中医药在缓解KOA患者的临床症状以及提高患者生活质量方面有着显著的疗效。本实验运用传统中医药对大鼠膝骨性关节炎模型进行干预治疗并观察其疗效，探讨右归饮及其拆方对防治膝骨性关节炎的部分机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器碘乙酸盐（上海谱振科技有限公司），ELISA试剂盒（美国Cusabio公司），YTX-3000高解析度X光检测设备（美国KODAL公司）。

1.2主要药物右归饮（由熟地黄、山茱萸、山药、枸杞子、甘草、杜仲、肉桂、制附子等组成）、温补肾阳方（由制附子、肉桂组成）、温益精血方（由熟地黄、山药、山茱萸组成）、温肾益血方（由枸杞子、杜仲组成）。以上药物均为水煎剂，每剂300 ml，由浙江中医药大学骨伤研究所药物制剂室提供。

1.3动物成年SD大鼠108只，雄性，SPF级，体重150±20 g，由中国科学院上海实验中心提供，动物许可证号：ACXK（沪）2014-0027；动物设施、饲料等均由浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.4动物分组以及模型的制备108只成年SD大鼠随机分组为正常对照组、右归饮组、温补肾阳方组、温益精血方组、温肾益血方组及模型组各18只。除正常对照组外，根据Pomonis等［4］方法制备大鼠膝关节骨性关节炎模型：在无菌操作室中，用水合氯醛注射大鼠腹腔使其麻醉，然后用碘乙酸盐1 mg分别注射入大鼠双膝关节腔内。

1.5实验动物给药以及处理KOA模型制备成功后,按照“人-大鼠体表面积比值”折算成相当于人的日用临床剂量,即含药量20 g/kg灌胃给药，每日2次，正常对照组、模型组按照以上标准给予生理盐水灌胃。给药4周、8周、12周后分批对6组大鼠进行处理（每组随机处死6只）：腹腔麻醉后分别抽取双膝关节腔灌洗液（置于-80℃保存）和截取双膝关节（置于10%甲醛溶液中保存），以便观察与检测。

1.6观察指标与方法

1.6.1一般情况观察包括大鼠的食欲、体重、步态、精神状况、毛发色泽、呼吸以及心率等生理指标进行观察。

1.6.2X-ray检查对各组大鼠膝关节进行X-ray检查，观察膝关节退变情况，如关节软骨的形态与完整性、关节间隙、骨赘等。

1.6.3组织病理学检测将双侧膝关节沿中心矢状面切成两半，置于10%甲醛溶液中固定48 h，经0.27 mol/ml EDTA-2Na脱钙2个月,每隔1周更换脱钙液。脱钙后进行常规HE染色。HE染色切片观察软骨面、滑膜和细胞结构。

1.6.4ELISA法检查关节液中的IL-1β含量切开关节腔，用1 ml生理盐水冲洗关节腔，收集关节液。按照ELISA试剂盒说明书方法检测IL-1β蛋白质水平。

1.7统计学处理采用SPSS 17．0统计软件进行分析，数据均以均数±标准差（±s）表示，组间差异采用单因素方差分析，2组间均数比较采取LSD-t检验。

2　实验结果

2.1一般情况观察造模后的第2天大鼠均出现精神萎靡、食欲不振、双膝肿胀、行动不利、反应迟钝等，1周后基本恢复正常，双膝明显跛行。治疗4周后，模型组动物跛行基本无改善，其余四组动物行走较稳健，但仍有跛行。8周后模型组动物行走时稍有改善，其余四组动物行走时较为活跃，无明显跛行。12周后，模型组动物较为活跃，无明显跛行，余四组动物活动活跃，基本无跛行。治疗前后大鼠毛发色泽基本无明显变化。

2.2X-ray检查治疗4周后，右归饮组X-ray检查显示膝关节关节软骨变薄或消失，关节间隙明显变窄，关节面边缘硬化，关节鼠形成；模型组X-ray检查显示膝关节间隙明显变窄，关节软骨变薄，轻度骨刺，关节面硬化。治疗8周后右归饮组X-ray检查显示膝关节关节软骨变薄，关节间隙狭窄，关节面硬化以及骨刺形成；模型组X-ray检查显示膝关节间隙变窄，关节软骨变薄，关节面边缘硬化以及骨赘形成。治疗12周后右归饮组X-ray检查显示膝关节关节软骨轻度变薄，关节间隙无明显狭窄，少量骨赘；模型组X-ray检查显示膝关节间隙明显变窄，关节软骨变薄或消失，关节面边缘硬化，骨赘形成以及关节半脱位。见图1。

2.3组织病理学观察治疗4周后，模型组大鼠膝关节有明显的关节软骨脱失，软骨层明显变薄，软骨细胞排列紊乱，骨小梁稀疏变细、结构紊乱；右归饮组大鼠关节面不光滑，软骨细胞排列尚整齐，分布均匀，骨小梁的结构与形态较模型组完整，但骨小梁有部分碎裂。治疗8周后，模型组关节面破坏严重，甚至出现大面积脱落，骨小梁碎裂，伴有软骨坏死、软骨下骨硬化；右归饮组关节面软骨、骨小梁形态以及结构明显改善。治疗12周后，模型组软骨关节面坏死，溃疡的形成甚至形成骨脓肿；右归饮组关节软骨面比较完整，无坏死、溃疡，骨小梁结构、形态完整。见图2。

2.4关节液中IL-1β的表达6组实验小鼠的关节液均能检查到IL-1β的表达。模型组的IL-1β含量与正常对照组治疗后4周有显著性差异（P<0.05），8周、12周时有极显著性差异（P<0.01）；与模型组相比，治疗后4周、8周、12周时右归饮组、温补肾阳方组、温益精血方组、温肾益血方组关节液中的IL-1β含量下降（P<0.05）；右归饮组与拆方组相比，第8周、12周时关节液中的IL-1β含量明显下降（P<0.05），表明右归饮降低IL-1β含量较其他组明显，从而抑制了IL-1β的表达，保护关节软组织。见表1。

图1　治疗后右归饮组和模型组X-ray表现

表1　治疗后各组关节液中IL－1β表达（μg/ml，±s）

表1　治疗后各组关节液中IL－1β表达（μg/ml，±s）

注：与正常对照组相比较，①P<0.05，②P<0.01；与模型组比较，③P<0.05；与右归饮组比较，④P<0.05

组别n治疗后4周治疗后8周治疗后12周正常对照组右归饮组温补肾阳方组温益精血方组温肾益血方组模型组666666 2.87±0.16 3.56±0.29③3.97±0.31③3.83±0.30③3.85±0.33③4.46±0.45①2.67±0.36 3.06±0.35③3.59±0.17③④3.71±0.44③④3.58±0.26③④4.35±0.51②2.58±0.11 2.62±0.18③3.08±0.25③④3.64±0.24③④3.44±0.38③④4.19±0.42②

图2　治疗后模型组和右归饮组HE染色

3　讨论

膝骨性关节炎病变的主要机理是关节软骨退行性改变和破坏。王旭光等［5］研究表明，在骨性关节炎发生发展的病理过程中炎症因子与细胞凋亡对滑膜、关节软骨以及软骨下骨的破坏起着重要作用。IL-1β和TNF-α是促进软骨基质降解和关节软骨破坏最重要的细胞因子，其对关节软骨和关节滑膜具有一定的破坏作用［6］。Kobayashi等［7］研究证实了IL-1β和TNF-α在OA患者的关节液中含量明显升高。IL-1β不仅能抑制透明软骨特异性Ⅱ、Ⅳ胶原蛋白多糖的合成，还可以诱导NF-kappB家族成员bcl-3基因，抑制bcl-3因子的表达，从而促进软骨细胞凋亡［8-9］。本实验研究结果显示中药组IL-1β的含量与模型组在治疗4周、8周、12周后相比有明显的差异，说明右归饮、温补肾阳方、温益精血方以及温肾益血方对骨性关节炎都具有一定的疗效。而右归饮组的IL-1β的含量无论是在早期还是晚期与其拆方组相比都明显降低，表明右归饮降低IL-1β含量较其拆方组明显，因此右归饮具有保护关节软骨、在一定程度上缓解或减轻骨性关节炎病情的作用。

中医学认为，膝骨性关节炎属“骨痹”“腰腿痛”等范畴，乃风寒湿邪侵入所致；病因为气滞血瘀、经络痹阻，病理因素为肝肾亏损、血气不足、风寒湿邪痹阻经络，病理特点“本虚标实、虚实夹杂”，其本为肾虚，标为血瘀；治疗方法多采用滋补肝肾、祛风散寒除湿、行气活血以及舒经通络等。故本实验选用的滋补肝肾方名方右归饮具有温补肾阳、补血益精的作用，方中附子、肉桂温补肾阳而祛寒即温补肾阳方，熟地黄为君，甘温滋肾以填精，寓阴中求阳之意；山茱萸、山药养血滋阴，使阳有所附即温益精血方；枸杞补肝肾养血，杜仲益肾强腰脊即温肾益血方。有研究表明右归饮含药血清既可以促进软骨细胞合成人Ⅱ胶原（ColⅡ），又可以促进成骨细胞增殖分化成熟，从而表明右归饮在体内可能诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）使成骨细胞向软骨细胞分化［10］。吴云刚等［11］研究表明，右归饮对激素性股骨头坏死患者受抑制的骨髓间充质细胞活化具有一定的促进作用,并能促其分化成成骨细胞。此外，右归饮能抑制软骨细胞凋亡基因，但对促使软骨细胞增生的基因具有一定的增强作用，其作用机体尚待进一步研究［12］。右归饮组病理学和X-ray表现与模型组相比无论是在治疗早期还是晚期都具有明显的改善作用，说明右归饮具有促进软骨组织修复、保护关节软骨的作用。

本实验研究初步表明右归饮以及其拆方对膝骨性关节炎的治疗具有一定的疗效，不仅可以对抗膝骨性关节炎软骨细胞的凋亡，还能保护软骨细胞，从而促进软骨细胞修复达到减轻或缓解膝骨性关节炎损伤的目的，且右归饮组较其拆方组作用更加显著。但其有效成分、药理作用以及减少软骨细胞凋亡作用机制等都有待进一步研究与解决。

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［6］嵇波，刘清国，覃蔚岚，等.针刀松解法、电针对膝关节骨关节炎兔IL-1β、IL-6、TNF-α含量影响的比较［J］.中国病理生理杂志，2009，25（6）:1165.

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［11］吴云刚，肖鲁伟，童培建.右归饮对激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓骨活性影响的实验研究［J］.中国骨伤，2009，22（2）:115-117.

［12］谢根东，罗志红，曾一林，等.加减右归饮对实验性兔膝关节骨关节炎软骨细胞凋亡的影响［J］.中国医药，2008，3（11）:663-664.

（编辑刘强）

Experimental Study of Yougui Decoction and Its Compatible Composition on Preventing and Curing Rats with Knee Osteoarthritis

WANG Gang1,LU Chao-feng1,Shan Le-tian1,YING Hang1，2
（1.The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,Zhejiang,310053；2.Zhejiang Prorincial Hospital of TCM,Hangzhou,Zhejiang,310006）

［Objective］To study the effect of Yougui decoction and its compatible composition（formulae of warming and tonifying kidney-yang,essence and blood）on imaging,histopathology and synovial fluid interleukin-1β（IL-1β）expression of SD rats with knee osteoarthritis.［Methods］108 SD male rats（weight:150±20g）were randomly divided into control group,Yougui decoction group, tonifying kidney-yang group,warming essence and blood group,warming kidney and blood group,model group（18 rats for each group）.Iodoacetic acid was injected into the knee joint cavity of the rats to prepare the osteoarthritis animal model.The sample was obtained from the 6 groups of rats in batches 4,8,12 weeks after lavage.Then the appetite,weight,gait,mental status,hair color, breathe,heart rate,imaging X-ray manifestation,pathological section with HE staining and the content of IL-1 beta in joint fluid were detected.［Results］Rats after modeling showed symptoms of depression,loss of appetite,swelling in both knees,adverse action, lags in response,etc.Four,eight,twelve weeks after treatment,compared with model group,the X-ray manifestation of Yougui decoction group showed that mild thinning of the articular cartilage.There was no obvious joint space narrowing and mild osteophyte either. Compared with model group,the histopathology of Yougui decoction group showed relatively intact articular cartilage,no necrosis,no ulceration,intact trabecular structure and morphology.The content of IL-1 beta in joint fluid of the model group was significantly higher than that of the control group（P﹤0.05）.Compared with model group,the content of IL-1 beta in joint fluid of Yougui decoction group and its compatible composition groups decreased（P﹤0.05）.Compared with the compatible composition groups,the content of IL-1 beta in joint fluid of Yougui decoction group decreased significantly（P﹤0.05）.［Conclusion］Yougui decoction and its compatible formulae can ease articular cartilage damage of knee osteoarthritis to a certain extent.The relief function will be even more significant with extended treatment so as to prevent osteoarthritis.

Yougui decoction;osteoarthritis;compatible composition;Interleukin-1β

R684.3

A

2095-4441（2016）01－0001－04

2015-10-25

浙江省自然科学基金资助项目（编号：LY13H270014）

应航，E-mail:yh@zcmu.edu.cn