于丹军， 樊　静， 刘广贤， 胡　月， 赵　月， 薛丹凤， 孙凤英

(1.秦皇岛市第一医院 检验科， 河北 秦皇岛　066000； 2.秦皇岛市第四医院 检验科， 河北 秦皇岛　066000； 3.解放军307医院 肿瘤研究所， 北京　100071)



子宫内膜癌患者外周血调节性T细胞与肿瘤免疫的相关性*

于丹军1， 樊静2**， 刘广贤3， 胡月1， 赵月2， 薛丹凤2， 孙凤英2

(1.秦皇岛市第一医院 检验科， 河北 秦皇岛066000； 2.秦皇岛市第四医院 检验科， 河北 秦皇岛066000； 3.解放军307医院 肿瘤研究所， 北京100071)

目的： 研究子宫内膜癌(EC)患者外周血CD4+CD25+CD127LOW和CD4+CD25+foxp3+调节性T细胞(Treg)的百分比(CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4)与EC患者血清白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、TGF-β2水平的相关性，探讨CD4+CD25+Treg在肿瘤免疫逃逸中的作用机制。方法： 30例确诊的EC患者(EC组)及30例健康体检女性(对照组)，用流式细胞术分别检测EC组手术前后和化疗后及对照组外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4，同时用ELISA法检测上述时点2组被检者血清IL-10、TGF-β1及TGF-β2含量；比较对照组、EC组手术前外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量，比较EC患者手术前、手术后及化疗后外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4 、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2及IL-10含量，采用spearman相关分析法分析EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4与手术前血清IL-10、TGF-β1及TGF-β2含量的相关性。结果： 与对照组比较，EC组患者手术前外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4、血清IL-10的含量均明显升高, TGF-β2含量明显降低(P<0.01)；与手术前比较，EC组患者手术后及化疗后CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4、血清IL-10和TGF-β2含量明显降低(P<0.01)，手术后血清TGF-β1含量无明显变化(P>0.05)，而化疗后血清TGF-β1含量明显降低(P<0.01)；EC组患者CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4与血清TGF-β1含量存在正相关(r=0.284,P=0.049)，CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4与血清IL-10含量存在正相关(r=0.287,P=0.047)。结论： EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg、CD4+CD25+Foxp3+Treg水平上调，可能是肿瘤产生免疫耐受，发生肿瘤免疫逃逸的原因。

子宫内膜肿瘤； 调节性T细胞； 细胞因子； 免疫耐受； 流式细胞术

子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)是妇科三大恶性肿瘤之一，有研究发现妇科恶性肿瘤的发生、发展与肿瘤免疫逃逸密切相关[1]。CD4+CD25+调节性T细胞(T regulatory cell, Treg)是一种新型的免疫抑制细胞，能维持机体耐受和免疫稳定的状态，预防自身免疫性疾病，CD4+CD25+Treg能降低肿瘤免疫治疗的效果，产生免疫抑制，在肿瘤免疫的逃逸中起到重要作用[2-3]。研究发现，恶性程度越高的EC患者体内CD4+CD25+Treg细胞越多，患者的预后越差[4]。因此，推测外周血中CD4+CD25+Treg可能参与了EC的发生和发展。本研究通过比较EC患者外周血中CD4+CD25+CD127LOWTreg及CD4+CD25+foxp3+Treg在CD4+T淋巴细胞(CD4)中的百分比(CD4+CD25+CD127LOWTreg/ CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4)及其与血清中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)、TGF-β2和白细胞介素-10(interleukin-10)等细胞因子的相关性，了解CD4+CD25+Treg在EC的发生及发展中的意义。

1　对象与方法

1.1对象、试剂及仪器

选择2014年8月～2015年8月经病理确诊的EC患者30例作为EC组，EC患者确诊后均未进行放化疗、未行激素或者生物免疫治疗，42～75岁，平均(52.3±7.6)岁；中低分化10例，高分化20例；Ⅰ～Ⅱ期18例， Ⅲ～Ⅳ期12例。选择同时期的健康女性体检者30例为对照组，33～77岁，平均(50.5±6.7)岁；均未妊娠，排除近期感染和自身免疫性疾病、使用糖皮质激素和非甾体类药物者。两组被检者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获医院伦理委员会批准，所有被检者均签署知情同意书。仪器为Beckman Coulter EP-ICS XL流式细胞仪(购自美国贝克曼公司)，试剂有鼠抗人 FITC-CD4、PE-CD25、PC5-CD127、同型对照鼠抗人IgG(购自美国贝克曼公司)、Foxp3(Forkhead /winged-helix transcription factor box P3 )试剂盒(购自美国ebioscience公司)，IL-10、TGF-β1及TGF-β2试剂盒(购自Rapibio公司)。

1.2方法

1.2.1标本采集EC组于手术前1 d、手术后1个月及化疗4个周期后，对照组于体检时采集静脉血8 mL，均分3管；两管用EDTA抗凝，分别测定CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4；第3管不抗凝，静置分层，收集血清测定IL-10、TGF-β1及TGF-β2水平。1.2.2CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4检测采用流式细胞术，取1.2.1项下2管抗凝全血，分别加入鼠抗人FITC-CD4、PE-CD25、PC5-127抗体或PC5-Foxp3抗体及同型对照，避光孵育15 min进行表面染色，固定破膜后加入相应荧光抗体，离心弃上清后上机检测。

1.2.3IL-10、TGF-β1及TGF-β2的检测采用ELISA法，取1.2.1项下分离的血清，按照试剂盒说明书的操作步骤检测IL-10、TGF-β1及TGF-β2含量。

1.3观察指标

比较对照组与EC组患者手术前外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/ CD4 、CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4和血清TGF-β1、TGF-β2及IL-10含量，比较EC患者手术前、手术后及化疗后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量，采用spearman相关分析法分析EC患者外周血D4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4与手术前血清TGF-β1、TGF-β2及IL-10含量的相关性。

1.4统计学方法

2　结果

2.1外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

与对照组比较，EC组患者手术前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4、血清IL-10的含量均明显升高, TGF-β2含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；TGF-β1含量虽然升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1。

表1　对照组与EC组手术前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

注： A、C为对照组，B、D为EC组图1　对照组与EC组手术前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4Fig.1　The CD25+foxp3+ Treg CD25+CD127LOWTreg accounted for CD4+ T lymphocyte ratio in peripheral blood of two groups

2.2EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

与手术前比较，EC患者手术后及化疗后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4、血清TGF-β2、IL-10含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；手术后TGF-β1含量无明显变化(P>0.05)，化疗后明显降低(P<0.01)。见表2。

表2　EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

(1)与手术前比较，P<0.01；(2)与手术后比较，P<0.01

2.3EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4与血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量的相关分析

spearman相关分析结果显示，EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4与血清TGF-β1含量存在正相关(r=0.284,P=0.049)，与TGF-β2、IL-10无相关性(r=0.109、0.092,P=0.300、0.266)；CD4+CD25+Foxp3+/CD4与血清IL-10含量存在正相关(r=0.287,P=0.047)，与TGF-β1、TGF-β2无相关性(r=-0.221、-0.097，P=0.101、0.290)。

3　讨论

EC占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%，其发病率近年呈上升趋势，且Ⅳ期患者5年生存率仅为5 %～23 %[5]。目前，以肿瘤免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已成为继手术、化疗及放疗治疗肿瘤不可缺的新模式，大量研究提示恶性肿瘤患者的免疫系统在肿瘤局部和全身处于耐受或缺陷状态，肿瘤在逃逸机体的免疫机制之后才能进一步恶化[6]。Treg是具有显著免疫抑制作用的CD4+T细胞亚群，对免疫系统功能具有抑制效应，与肿瘤细胞的免疫逃逸与免疫耐受密切相关[7]。Foxp3是叉头翼状螺旋转录因子的总称，在Treg细胞上特异性表达，可以促进肿瘤的生长、抑制机体抗肿瘤免疫应答，在Treg的发育和功能上起着重要的作用[8]。Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞生长发育和调节功能的重要因子，是研究人类CD4+CD25+Treg细胞最具特异性的细胞分子标志物[9]。CD127是Treg 特异性较高的细胞表面标志物，用CD127筛选的Treg在体外实验显示出特有的抑制活性，能区分效应性T细胞[10]。CD127为IL-7的受体α链，在Treg细胞表面特异性低表达，与Foxp3表达有很好的相关性，本实验采用CD4+CD25+CD127LOW与CD4+CD25+Foxp3+两组抗体共同筛选Treg细胞，结果显示，EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4均高于对照组(P<0.01)，说明经过相应治疗后，CD4+CD25+Treg数目明显下降，CD4+CD25+Treg在肿瘤的免疫逃逸中起到了重要的作用。

Treg细胞在肿瘤免疫逃逸中的发挥着重要的作用，分泌抑制性细胞因子如IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)等可诱导肿瘤的T细胞耐受，IL-10具有免疫抑制功能，TGF-β能够直接抑制CD8+CTLS激活，显著减弱肿瘤免疫的效果[11-12]。本文中，EC组与对照组血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量相比较，EC组IL-10含量明显高于对照组，TGF-β2含量明显低于对照组(P<0.01)，TGF-β1含量虽有升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；研究还发现EC组手术后和(或)化疗后的TGF-β1、TGF-β2和IL-10含量均较手术前明显下降(P<0.01)，说明EC组织诱导产生的TGF-β和IL-10可能也发挥一部分作用；Mao等[12]研究发现在恶性肿瘤患者中CD4+CD25+Foxp3foxp3+Treg含量明显增加，有研究也证实，卵巢癌患者Treg细胞数量的增加与卵巢癌的进展程度呈正相关[14-15]。本文相关性分析结果显示，CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4与 TGF-β1、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4与 IL-10含量之间存在着正相关(P<0.05)，提示血清中TGF-β1、IL-10水平变化可间接反映EC的肿瘤免疫进展情况。

综上，EC患者体内CD4+CD25+Treg细胞明显上调，可能参与了肿瘤的免疫逃逸，其机制可能与 IL- 10、TGF-β表达上调有关。进一步研究如何调控EC患者体内Treg的表达水平和血清中TGF-β1、TGF-β2及IL- 10的含量达到精准治疗有望为抗肿瘤免疫治疗提供新的思路。

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(2016-05-25收稿，2016-08-15修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 赵毅

Correlation of Regulatory T Cells with Tumor Immunology in Peripheral Blood of patients with Endometrial Cancer

YU Danjun1, FAN Jing2, LIU Guangxian3, HU Yue1, ZHAO Yue2, XUE Danfeng2, SUN Fengying2

(1.ClinicalLaboratory,FirstHospitalofQinhuangdaoCity,Qinhuangdao066000,Hebei,China; 2.ClinicalLaboratory,FourthHospitalofQinhuangdaocity,Qinhuangdao066000 ,Hebei,China; 3.InstitudeofTumor, 307LiberationArmyHospital,Beijing100071,China)

Objective: To investigate the relationship between two types of regulatory T cells (CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+Foxp3+Treg) expression in peripheral blood of patients with endometrial cancer (EC) and tumor immunity. Methods: 35 patients with EC were selected and 30 healthy female as healthy controls, flow cytometry was used to detect the proportion of CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte expression in peripheral blood in EC group and healthy controls before and after surgery and chemotherapy; ELASA was used to detect content of IL-10 cytokines, TGF-β1and TGF-β2in serum with the same specimens. Results: The proportion of CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte in peripheral blood in patients and content of IL-10 in serum with EC group were significantly higher than that in healthy controls (P<0.01); the content of TGF-β1 in serum was no statistically significant different in two groups (P>0.05); The proportion of CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte in peripheral blood in patients and content of IL-10 and TGF-β2in serum with endometrial cancer group were significantly decreased after surgery and chemotherapy (P<0.01); there was no statistically significant difference in the content of TGF-β1in serum after surgery (P>0.05); the content of TGF-β1in serum were significantly decreased after chemotherapy (P<0.01). There was positive correlation between CD4+CD25+CD127LOWTreg and content of TGF-β1(r=0.284,P=0.049) with EC group; there was positive correlation between CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte and the content of IL-10 (r=0.287,P=0.047). Conclusion: The levels of regulatory T cells increased obviously in peripheral blood in patients with EC, this may be the reason for tumor immunological tolerance and tumor immune escape.

endometrial neoplasms; regulatory T cells; cytokines; immunological tolerance; flow cytometry

秦皇岛市科技局科技支撑计划项目资助(20141A219)

E-mail:qhdjykfj@126.com

R737.33

A

1000-2707(2016)09-1099-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.027

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网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.006.html