冯海潮， 孙朝琴， 张　姝， 何　芸， 吴　琼， 莫　非， 罗昭逊*

(贵州医科大学， 贵州 贵阳　550004)



头花蓼对幽门螺杆菌胃炎大鼠血清干扰素-γ和白细胞介素-4含量的影响*

冯海潮**， 孙朝琴， 张姝， 何芸， 吴琼， 莫非， 罗昭逊***

(贵州医科大学， 贵州 贵阳550004)

目的： 探讨苗药头花蓼对幽门螺杆菌(H.pylori)感染相关性胃炎大鼠血清干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)含量的影响。方法： 30只SD大鼠随机分为空白组、模型组及头花蓼组,采用H.pylori灌胃造模，空白组灌胃无菌脑心浸液肉汤，模型组和头花蓼组用消炎痛预处理后灌胃H.pylori制作H.pylori感染相关性胃炎大鼠模型，之后空白组和模型组大鼠灌胃生理盐水、头花蓼组大鼠灌胃头花蓼2周；采用HE染色评估胃黏膜炎炎症损伤程度，酶联免疫(ELISA)法检测3组大鼠血清IFN-γ、IL-4含量，实时荧光定量PCR(real time-PCR)检测胃黏膜中IFN-γ、IL-4 mRNA的相对表达水平。结果：H.pylori灌胃造模后，大鼠胃窦黏膜有H.pylori定植，HE染色结果显示模型组大鼠胃组织呈现相关性胃炎病理形态改变；头花蓼干预后，H.pylori感染大鼠胃黏膜炎症明显改善，IFN-γ mRNA表达水平明显下调、IFN-γ血清含量明显降低，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；而头花蓼干预对IL-4分泌的影响比较轻。结论： 头花蓼可减轻H.pylori对胃黏膜炎性损伤，其机制可能是通过下调IFN-γ mRNA转录水平而实现的。

头花蓼； 苗药； 幽门螺杆菌； 干扰素-γ； 白介素-4； 炎症； 大鼠，Sprague-Dawley

头花蓼是贵州省的精选苗药，具有清热利湿，活血解毒的功效，对幽门螺杆菌具有抗菌活性[1-3]。课题组前期研究发现头花蓼体外可刺激淋巴细胞增殖，促进干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)和白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)的分泌，参与机体免疫调节[4]。INF-γ、IL-4分别作为T淋巴细胞的两种亚型Th1型和Th2型的代表因子，其分泌水平可一定程度上反映机体的免疫状态。本研究采用酶联免疫(ELISA)和实时荧光定量PCR(real time-PCR)方法检测头花蓼治疗前后H.pylori胃炎大鼠血清IFN-γ、IL-4的含量及胃黏膜IFN-γ、IL-4 mRNA相对表达水平，旨在探讨头花蓼改善H.pylori感染相关性胃炎的免疫调节作用机制。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

头花蓼浸膏粉(批号141196)，由浙江众益有限有限责任公司提供。H.pylori驯化株SS200由中国疾病控制中心传染病所张建中教授惠赠，保存于贵州医科大学医学检验学院临床检验教研室。SPF级SD大鼠30只，周龄6～8周，体质量150～180 g，购自第三军医大学实验动物中心，合格证号SYXK(渝)2012-0001，实验获得贵州医科大学伦理委员会批准。试剂有哥伦比亚血琼脂粉(购自Oxoid)，脑心浸液琼脂(购自Oxoid)，无菌脱纤维羊血(购自南京便诊生物科技有限公司)，ELISA试剂盒(购自ebioscience)，RNA提取试剂盒(购自Omega)，RNA逆转录试剂盒(购自Takara)，real time-PCR试剂盒(购自Takara)。主要仪器有酶标仪(BIO-xMark生产)，三气培养箱(Thermo生产)，荧光定量PCR仪(购自德国ROCHE)。

1.2方法

1.2.1H.pylori培养和菌液制备H.pylori培养：H.pylori复苏后稳定传代3次，取长势良好菌苔接种于哥伦比亚血琼脂平板，置微需氧环境(85%N2，10%CO2，5%O2)培养48 h。菌悬液制备：无菌接种环从哥伦比亚血琼脂平板上收集H.pylori菌落，以预冷的无菌脑心浸液肉汤制成混悬液，3 000 g，4 ℃离心3 min后，弃上清液，洗涤3次，采用比浊法调整菌悬液浓度为1×1012cfu/L，预冷，备用。

1.2.2H.pylori感染相关性胃炎大鼠模型30只SPF级SD大鼠随机分为空白组、模型组和头花蓼组，每组10只；参照文献[5-6]，大鼠适应性饲养1周后，禁食禁水12 h，模型组和头花蓼组采用1.0 mL/只的消炎痛药液(1g/L)预处理6 h后用H.pylori悬液1.5 mL/只隔天灌胃，连续5次；空白组以等量的无菌脑心浸液肉汤代替。灌胃8周后，每组随机取3只大鼠处死，留取胃窦黏膜组织用于H.pylori相关性胃炎模型鉴定。

1.2.3H.pylori相关性胃炎模型鉴定H.pylori感染的鉴定：采用快速尿素酶实验、组织切片Giemsa染色以及细菌培养检测H.pylori，3项实验中至少2项阳性判断为H.pylori感染。H.pylori相关性胃炎评价：取胃窦黏膜组织用4%中性甲醛固定，常规HE染色，病理医生双盲阅片，行胃黏膜慢性炎症评分。SD大鼠胃黏膜有H.pylori定植且出现慢性炎症病理学改变，判断为造模成功。

1.2.4头花蓼干预治疗成功建模后，头花蓼组参照文献[7-8]的头花蓼临床[3.49 g生药/(kg·d)]3倍剂量作为治疗H.pylori感染SD大鼠的给药剂量进行灌胃处理，连续14 d(1次/d)，空白组和模型组给予等量的无菌生理盐水。治疗结束后4周处死所有大鼠，留取大鼠胃窦黏膜组织和静脉血，用于后续研究。

1.2.5血清FN-γ和IL-4含量取各组大鼠血清200 μL，采用ELISA法检测血清IFN-γ和IL-4含量，具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.6胃黏膜组织IFN-γ、IL-4 mRNA表达采用real time-PCR法，用Omega试剂盒提取胃窦黏膜组织的RNA，逆转录为cDNA。采用SYBR ®Ⅱ进行real time-PCR，引物由上海生物工程技术服务公司合成，引物信息见表1。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40个循环。采集IFN-γ、IL-4、β-actin内参照基因各循环荧光信号，用EXCEL软件计算Ct值、ΔΔCt值及相对表达值RQ，ΔCT=CT目的基因-CT内参基因，ΔΔCT=ΔCT给药组-ΔCT模型组，IFN-γ、IL-4的RQ以2-ΔΔCT表示。

表1　PCR引物信息、基因序列号及产物大小

1.3统计学分析

2　结果

2.1H.pylori相关性胃炎模型

H.pylori感染8周后，模型组大鼠胃黏膜快速尿素酶实验阳性，Giemsa染色见胃窦腺腔内分布有细小、弯曲的短杆菌，微需氧培养见细小、湿润、透明的针尖样菌落，菌落经尿素酶、触酶和氧化酶实验证实为H.pylori，H.pylori感染率为100%； HE染色结果显示模型组大鼠胃黏膜破损、糜烂，腺体肿胀，黏膜下层有大量淋巴细胞浸润，甚至形成淋巴肉芽肿，呈现相关性胃炎病理形态改变(图1)。说明成功构建H.pylori感染相关性胃炎动物模型。

2.2大鼠胃黏膜组织的HE染色及病理评分

HE染色结果显示，空白组大鼠胃黏膜完整，腺体规则，黏膜下层偶见淋巴细胞浸润；模型组大鼠胃黏膜破损、糜烂，腺体肿胀，黏膜下层有大量淋巴细胞浸润；经头花蓼治疗后，大鼠胃黏膜损伤得到一定程度的修复，黏膜比较完整，腺体比较规则，黏膜下层散在少量淋巴细胞浸润，炎症有所改善；与空白组病理评分比较，模型组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，头花蓼组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表2。

注：A 为空白组，B为模型组，C为头花蓼组；箭头为胃黏膜腺体肿胀图1　SD大鼠胃黏膜组织的病理学变化(HE，×400)Fig.1　The pathological change of gastric mucosa of SD rats

组别病理评分(分)空白组0.55±0.37模型组2.59+0.59(1)头花蓼组1.73±0.40(1)(2)

(1)与空白组比较，P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05

2.3血清FN-γ和IL-4含量

H.pylori感染后，模型组大鼠血清IFN-γ含量明显高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；经头花蓼治疗后，IFN-γ含量明显降低(P<0.05)。H.pylori感染后，模型组大鼠血清IL-4含量虽较空白组降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；经头花蓼治疗后，血清IL-4含量虽有所升高，但与模型组比较，差异也无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.4胃黏膜组织IFN-γ和IL-4 mRNA表达

与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜IFN-γ mRNA相对表达量升高，IL-4 mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)，经头花蓼治疗后，与模型组比较，大鼠胃黏膜IFN-γ mRNA的相对表达量下降，差异有统计学意义(P<0.05)； IL-4 mRNA的相对表达量虽有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：A为FN-γ，B为IL-4；(1)与空白组比较，P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05图2　大鼠血清FN-γ和IL-4含量Fig.2　Cytokine levels in serum of rats

注：(1)与空白组比较，P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05图3　3组大鼠胃黏膜组织中 IFN-γ、IL-4 mRNA相对表达量比较Fig.3　mRNA levels of IFN-γ and IL-4 of rat gastric mucosa in the three groups

3　讨论

H.pylori感染是引起胃炎、胃及十二指肠溃疡乃至胃癌的独立危险因素。随着广谱抗生素的广泛应用，使得H.pylori耐药株不断增加，研发高效及高选择性的抗H.pylori药物已成为趋势。有研究报道，中药或中西医结合用药可提高H.pylori根除率，改善胃黏膜炎症或抑制消化性溃疡，从现代医学角度分析有功效的中药抑制H.pylori感染的作用机制[9]。中药抑制H.pylori相关性胃炎的可能机制为抑制其毒力因子的表达、调节感染所致的免疫失衡、纠正胃肠激素分泌紊乱、干扰信号通路转导等。本研究采用头花蓼治疗H.pylori感染SD大鼠胃炎模型，对头花蓼的可能作用机制进行初步分析。辅助性T细胞Ⅰ型和Ⅱ型(Th1、Th2)在人体的免疫中起着重要作用。Th1主要执行因子是IFN-γ和IL-2，而Th2主要执行因子是IL-4、IL-10等，二者通过分泌不同的细胞因子，彼此交叉调节，相互抑制，共同维持Th1/Th2平衡。H.pylori感染后，其抗原持续刺激引起机体局部或整体发生免疫反应。人体和动物实验均证实H.pylori感染后胃黏膜发生以Th1型为主的免疫反应，Th1型细胞因子分泌增多，而Th2型细胞因子IL-4、IL-10很少或缺乏[10]。但机体在抵御外来抗原与限制自身组织损伤的过程中同时存在Th1、Th2反应与炎症反应自我平衡的过程，两种免疫反应相互制约，此起彼伏，其结果决定疾病的结局[11]。

本研究中，H.pylori感染后，大鼠胃黏膜IFN-γ mRNA表达量增高，血清IFN-γ水平上升，而胃黏膜IL-4 mRNA 表达明显降低，血清IL-4 水平无明显改变，胃黏膜呈现慢性炎症损伤。表明H.pylori感染后，发生了Th1偏移，Th2应答受到抑制，Th1应答分泌的大量IFN-γ，增强了局部各种炎症细胞如巨噬细胞、中性粒细胞的活性，刺激释放炎症介质、细胞因子、活性氧簇和活性单簇，引起胃上皮损伤，同时因IFN-γ与IL-4存在相互限制的关系，主要针对胞外感染的Th2应答受到抑制，H.pylori不能有效的被清除，细菌长期持续感染，胃黏膜损伤难以得到修复。另外，有研究报道H.pylori感染早期Th1应答占优势地位产生过量IFN-γ，增强各类炎症细胞活性，造成胃黏膜上皮细胞的损伤；而关于H.pylori感染后Th2应答出现较晚，说明Th2应答在H.pylori感染早期发挥作用甚微[12]。本研究中大鼠血清Th2型细胞因子在H.pylori感染后或经治疗后，其水平变化轻微，支持以上观点。经头花蓼治疗后，IFN-γ mRNA表达量降低，血清IFN-γ水平降低，IL-4 mRNA及血清IL-4含量有所升高，提示头花蓼在促进T细胞向Th2细胞分化方面起重要作用，能抑制IFN-γ水平并下调Th1型免疫反应，从而减轻由H.pylori感染所致的炎症反应。同时下调Th2应答的因素减弱，有利于炎症的恢复。

总之，本研究发现头花蓼可减轻大鼠胃黏膜炎症反应，其机制与降低IFN-γ等致炎因子水平，抑制H.pylori感染所致Th1/Th2失衡，从而减轻黏膜炎症有关。然而参与Th1/Th2免疫调节网络的细胞因子众多，彼此之间相互联系，关系错综复杂，关于头花蓼经何种途径调节Th1/Th2的失衡作用机制仍不明确，还有待进一步研究证实。

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(2016-04-28收稿，2016-08-12修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 赵毅

Effects ofPolygonumcapitatumon Content of IFN-γ and IL-4 in Rats withHelicobacterpyloricGastritis

FENG Haichao, SUN Chaoqin, ZHANG Shu, HE Yun, WU Qiong, MO Fei, LUO Zhaoxun

(GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effects ofPolygonumcapitatumon content of IFN-α and IL-4 in rats withHelicobacterPyloricgastritis. Methods: 30 SD rats were randomly divided into blank group, model group andPolygonumcapitatumgroup. Gastritis was induced in rats by oral gavage withH.pylori; blank group was treated with sterile Brain Heart Infusion Broth, model group andPolygonumcapitatumgroup were first treated with indomethacin, then served to constructH.pyloriinfected relevance gastritis rats model. Blank group and model group were treated with normal saline irrigation,Polygonumcapitatumgroup were treated withPolygonumcapitatumirrigation for two weeks; HE staining was adopted to evaluate the Acute gastritis inflammation damage level, ELISA to test IFN-γ and IL-4 content of three groups; real time-PCR to test relative expression level of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA in mucositis. Result: After treatment, gastric inflammation inPolygonumcapitatumgroup was improved obviously. The mRNA expression and the serum content of IFN-γ inPolygonumcapitatumgroup were significantly lower than the model group, it was statistically significant (P<0.05). ButPolygonumcapitatumhad little effect on secretion IL-4 in the process of H.pylori infection. Conclusion:Polygonumcapitatumcould inhibitH.pylori-associated gastritis probably via down-regulation of IFN-γ mRNA expression.

Polygonumcapitatum;Miao medicine;Helicobacterpyloric; interferon-γ; interleukin-4; inflammation; rats,Sprague-Dawley

贵州省科学技术基金[黔科合(2014)2027号]； 贵州省科技合作计划基金[黔科合LH(2015)7417号]； 贵州省卫生计生委科学技术基金(gzwikj2015-1-003)； 贵阳市科技局计划项目[筑科合同(2014001)]

E-mail:418611578@qq.com

R931

A

1000-2707(2016)09-1037-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.011

**贵阳医学院2013级硕士研究生

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网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.018.html