张新文， 李盈甫， 史　荔， 马千里， 洪　超， 王婷婷， 俞建昆， 李传印， 姚宇峰， 杨慧娟

(1.中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所， 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室， 云南 昆明　650118； 2.昆明医科大学第一附属医院 干疗科， 云南 昆明　650032； 3.昆明医科大学第三附属医院 胸外科， 云南 昆明　650118)



云南汉族人群HSPA1A基因多态性位点与肺癌的相关性研究*

张新文1， 李盈甫2， 史荔1， 马千里3， 洪超1， 王婷婷1， 俞建昆1， 李传印1， 姚宇峰1， 杨慧娟**

(1.中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所， 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室， 云南 昆明650118； 2.昆明医科大学第一附属医院 干疗科， 云南 昆明650032； 3.昆明医科大学第三附属医院 胸外科， 云南 昆明650118)

目的： 探讨HSPA1A基因多态性与肺癌发生发展的相关性。方法： 选取云南地区汉族人群肺癌患者288例为病例组，健康体检人群298例为对照组，采用TaqMan探针基因分型方法对HSPA1A基因中的4个多态性位点(SNPs)位点rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)、rs1008438(G>T)及rs1043618(G>C)进行基因分型，研究其等位基因、基因型及所构建的单倍型在两组人群中分布差异。结果： 2组人群rs1043618(G>C)等位基因C和G的分布频率差异有统计学意义(P=0.038)，其中等位基因C是肺癌发生的保护性因素[OR=0.767；95%CI(0.597～0.986)]；rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)和rs1008438(G>T)的等位基因和基因型的分布差异无统计学意义(P>0.05)；rs12190359与rs1008438(G>T)以及rs562047(C>G)与rs11043618(G>C)的单倍型在2组间分布频率差异无统计学意义(P>0.05)。结论：HSPA1A基因rs1043618(G>C)等位基因C可能是云南汉族肺癌发生的保护性因素。

肺肿瘤; HSPA1A; 单核苷酸多态性; 相关性； 汉族； 云南

肺癌是世界范围内死亡率最高的肿瘤，新发病例在亚洲和非洲呈逐年增加[1-2]。在中国，肺癌新发病例和死亡人数约为70万和60万。研究表明 ，吸烟是肺癌发生的重要因素[3]，但并非所有吸烟者均会发展为肺癌。近年来的研究显示，宿主遗传因素在肺癌发生过程中发挥重要作用，尤其是与肿瘤相关的基因中存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。鉴于位于启动子区域或5′-UTR区域的SNPs有可能会对基因的表达产生影响，而位于氨基酸编码区的SNPs有可能会对基因的功能产生影响，因此本研究选取HSPA1A基因启动子和5′-UTR区域的SNPs位点rs1008438(G>T)和rs1043618(G>C)，以及与Hsp70蛋白ATP结合相关的第110位和116位氨基酸密码子的SNPs位点rs562047(C>G)和rs12190359(C>T)，研究这些SNPs位点在肺癌患者以及健康对照人群中的分布情况，以期找到与肺癌发生具有相关性的HSPA1A基因中的多态性位点，为肺癌诊断及治疗提供新的靶点及思路。

1　对象与方法

1.1对象

根据“知情同意”原则，随机选取2012年10月～2014年5月确诊为肺癌的患者288例为病例组，采用世界卫生组织(WHO 2004)肺癌组织类型划分标准进行病理分型，采用国际肺癌临床分期系统进行临床分期。排除标准：(1)术前接受放化疗等抗肿瘤治疗的病例，(2)患有其他恶性肿瘤，或合并心血管疾病、糖尿病、肝炎、肾病等疾病的患者，(3)资料不全者。对照组288人为2013年10月～2016年5月正常体检者。所有对象均为居住于云南地区彼此无血缘关系的汉族个体，年龄30～75岁。病例组平均(55.55±10.67)岁，男女性别比197/91，病理类型鳞癌101例，腺癌178例，鳞腺癌5例，其他4例；临床分期Ⅰ+Ⅱ期92例，196例。对照组平均(54.01±10.12)岁，男女性别比192/96，两组被检者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

采集空腹静脉血5 mL，用EDTA 或肝素抗凝，使用QIAGEN血基因组DNA 小量试剂盒提取DNA。并用超微量紫外可见分光光度计(ND-2000，美国ThermoScientific公司)检测DNA的浓度和纯度。采用TaqMan探针荧光定量PCR方法检测SNPs位点的基因分型，TaqMan探针、引物和SNPs分型试剂(TaqMan Genotyping Master Mix)均购自美国ABI公司(http://www.appliedbiosystems.com)。罗氏LightCycler 480 实时荧光定量PCR 仪检测SNPs 位点及分型，PCR 反应体积为20 μL，反应条件为95 ℃预变性10 min，92 ℃变性15 s、60 ℃退火1 min，共40 个循环，40 ℃ 5 min 长延伸。以3 个已知基因型(野生纯合子、突变纯合子、杂合子)的标准样品作为对照，用罗氏LightCycler 480 基因分型软件(LCS480 1.5.1.62)进行结果分析和基因分型，同时对部分TaqMan分型结果进行测序验证。

1.3统计学分析

Hardy-Weinberg平衡检验样品的代表性。t检验检测两组被检者的年龄是否有差异，χ2检验检测病例组组和对照组性别差异及HSPA1A基因各SNPs 位点基因型和等位基因频率差异。SHEsis软件程序计算连锁不平衡，常用D’表示，D’值为0时、连锁完全平衡，D’值为1 时、连锁完全不平衡，D′>0.8时、认为存在强连锁[4]，根据连锁不平衡结果构建单倍型，并检测单倍型频率在病例组与对照组之间的差异[5]。多重比较时采用Bonferroni进行校正。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1样品的代表性

HSPA1A基因启动子区SNPs位点rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)、rs1008438(G>T)和rs1043618(G>C)的基因型在两组人群中的分布全部符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，说明本研究所采集的样本为具有群体代表性的随机样本。

2.2HSPA1A基因SNPs位点与肺癌的相关性

rs1043618(G>C)等位基因C和G分布频率在2组间比较，差异有统计学意义(P=0.038)，rs1043618(G>C)等位基因C是肺癌发生的保护性因素[OR=0.767；95%CI(0.597～0.986)]。rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)和rs1008438(G>T)基因型和等位基因分布频率在2组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　HSPA1A 4个SNPs位点基因型和等位基因频率在病例组和对照组人群中的分布

2.3HSPA1ASNPs位点连锁不平衡

连锁不平衡分析结果显示，病例组和对照组中rs12190359(C>T)、rs562047(C>G)、rs1008438(G>T)和rs1043618(G>C)间均存在连锁不平衡，其中rs12190359(C>T)与rs1008438(G>T)间、rs562047(C>G)与rs1043618(G>C)间存在强连锁(D’=0.918、0.964)；而rs12190359(C>T)与rs562047(C>G)、rs12190359(C>T)与rs1043618(G>C)、rs562047(C>G)与rs1008438(G>T)以及rs1008438(G>T)与rs1043618(G>C)间的连锁不平衡D′值均<0.8，这些位点间的连锁关系不明显。

2.4HSPA1A4个SNPs位点单倍型

根据连锁不平衡结果，构建HSPA1ASNPs4个位点中rs12190359(C>T)与rs1008438(G>T)以及rs562047(C>G)与rs1043618(G>C)之间的单倍型，并对出现频率>3%的SNPs位点单倍型进行分析，结果显示，在病例组与对照组中各单倍型的分布频率分别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　HSPA1A 4个SNPs位点的单倍型在病例组和对照组中分布频率

2.5HSPA1A4个SNPs位点与肺癌临床分期的关系

HSPA1A基因中4个SNPs的基因型和等位基因在肺癌Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期中的分布频率差异无统计学意义(P>0.05)，表明HSPA1A4个SNPs位点与肺癌的临床分期无关。见表3。

2.6HSPA1A4个SNPs与肺癌病理类型的关系

HSPA1A4个SNPs的基因型和等位基因在鳞癌患者和腺癌患者中的分布频率差异无统计学意义(P>0.05)，提示HSPA1A4个SNPs位点与肺癌的病理类型无关。见表4。

表3　 HSPA1A 4个位点SNPs位点基因型和等位基因在Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期肺癌患者中的分布

表4　HSPA1A 4个位点SNPs位点基因型和等位基因在肺鳞癌和腺癌患者中的分布

3　讨论

热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是一类在进化上高度保守的蛋白，Hsp70蛋白属于是一类应急表达的分子伴侣蛋白[6]。Hsp70家族中的HSPA1A是诱导型表达基因(编码Hsp70、Hsp72)。研究显示，存在于HSPA1B中的多态性位点可以影响HSPA1A和HSPA1B的表达量，甚至与肺癌患者的存活率具有相关性[7]，Gunther等[8]研究发现血清Hsp70蛋白水平高低影响肺癌肿瘤组织的生长。分子伴侣主要参与新合成多肽的折叠、多蛋白复合物的装配、蛋白质在细胞内的定位、蛋白质跨膜转运以及蛋白质经溶酶体途径的降解等过程[9-10]。Hsp70蛋白通常在细胞内是不表达或低表达，但当细胞受到各种刺激时，Hsp70蛋白会迅速累积，以应对细胞中大量新合成蛋白的折叠和转运，增强细胞应激能力[11]。肿瘤的发生发展过程需要肿瘤细胞内大量蛋白的合成，具有典型的压力表型，因此在乳腺癌、结直肠癌、肝癌、前列腺癌、食道癌以及宫颈癌中均出现了Hsp70蛋白的高表达[12]。相关研究显示，Hsp70蛋白与细胞增殖、迁移、侵袭和抗凋亡有关[13]。临床研究也显示，Hsp 70蛋白的高表达会导致较差的预后[14]。以上资料表明Hsp70的表达量多少在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。存在于基因中的SNPs可以影响基因的表达与功能，从而与许多疾病(包括癌症)相关。目前已有大量研究聚焦于HSPA1A基因中的SNPs与疾病的相关性。这些研究多针对于rs1008438(G>T)以及rs1043618(G>C)两个位点在不同人种中与不同疾病的相关性研究[14]。本研究选择HSPA1A基因中的SNPs位点rs1008438(G>T)以及rs1043618(G>C)，研究其在肺癌与健康人群中的分布频率，以期发现这些SNPs位点与肺癌的相关性。

本研究结果显示，rs1043618(G>C)等位基因C是肺癌发生的保护性因素。Gunther等[8]研究发现肺癌患者血清Hsp70蛋白水平明显高于健康对照人群， Dullin等[14]发现rs1043618(G>C)等位基因C以及rs1008438(G>T)等位基因G与细胞内Hsp70蛋白水平呈负相关。因此，推测位于基因5′-UTR区域的rs1043618(G>C)等位基因C可能不利于Hsp70的表达，从而在肺癌发生过程发挥保护作用。虽然Dullin等[14]的研究显示rs1008438(G>T)等位基因与Hsp70蛋白表达水平相关，但本研究结果发现rs1008438(G>T)等位基因和基因型与肺癌发生的关系并不明显。这可能与本研究样本量有关，鉴于其对Hsp70蛋白表达的影响，可能随着样本量的增加结果会有所改变。

本研究还选取了位于Hsp70蛋白功能区域氨基酸密码子中的SNPs位点进行研究，其中位于第110位氨基酸密码子的位点rs562047(C>G)可导致谷氨酸与天冬氨酸的错义突变，而位于第116位氨基酸的rs12190359(C>T)可导致氨基酸密码子的同义突变，结果显示这两个位点与肺癌的发生无关。这可能是因为即使该位点的等位基因导致Hsp70蛋白分子伴侣功能发生变化，但由于失去分子伴侣功能的Hsp70蛋白同样具有抗凋亡作用，未影响到Hsp70蛋白在肿瘤细胞中发挥作用[15]。本研究还分析了4个SNPs位点与肺癌严重程度以及病理类型的关系，发现这4个SNPs位点在肺癌不同临床分期患者之间以及不同病理类型患者之间中的分布频率没有显著差异。

综上所述，本研究中HSPA1A基因中的4个SNPs位点，只有位于基因5’-UTR区域的rs1043618(G>C)与肺癌的发生具有相关性，其中等位基因C是肺癌发生的保护性因素。肺癌是一种治疗及预后都极差的恶性肿瘤，因此寻找与肺癌相关的肿瘤标志对于肺癌的诊断、治疗以及预后都具有重要意义。本研究结果对于研究肺癌发生发展机制以及肺癌诊断、治疗具有一定意义。

[1] Cheng TD, Cramb SM, Baade PD, et al. The international epidemiology of lung cancer: Latest trends, disparities, and tumor characteristics [J]. Journal of thoracic oncology : official publication of the International Association for the Study of Lung Cancer, 2016, DOI:10.1016/j.jtho.2016.05.021

[2] Mirsadraee S, Oswal D, Alizadeh Y, et al. The 7th lung cancer TNM classification and staging system: Review of the changes and implications [J]. World journal of radiology, 2012 (4): 128-134.

[3] Sasco AJ, Secretan MB, Straif K. Tobacco smoking and cancer: a brief review of recent epidemiological evidence [J]. Lung cancer (Amsterdam, Netherlands), 2004(Suppl.2):3-9.

[4] Shi YY, He L. SHEsis, a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium, haplotype construction, and genetic association at polymorphism loci [J]. Cell research, 2005(2): 97-98.

[5] Li Z, Zhang Z, He Z, et al. A partition-ligation-combination-subdivision EM algorithm for haplotype inference with multiallelic markers: update of the SHEsis (http://analysis.bio-x.cn) [J]. Cell research, 2009 (4): 519-523.

[6] Lindquist S, Craig EA. The heat-shock proteins [J]. Annual review of genetics, 1988(22):631-677.

[7] Szondy K, Rusai K, Szabo AJ, et al. Tumor cell expression of heat shock protein (HSP) 72 is influenced by HSP72 [HSPA1B A(1267)G] polymorphism and predicts survival in small Cell lung cancer (SCLC) patients [J]. Cancer investigation, 2012 (4): 317-322.

[8] Gunther S, Ostheimer C, Stangl S, et al. Correlation of Hsp70 Serum levels with gross tumor volume and composition of lymphocyte subpopulations in patients with squamous cell and adeno non-small cell lung cancer [J]. Frontiers in immunology, 2015(6):556.

[9]da Silva KP, Borges JC. The molecular chaperone Hsp70 family members function by a bidirectional heterotrophic allosteric mechanism [J]. Protein and peptide letters, 2011 (2): 132-142.

[10]Schlecht R, Erbse AH, Bukau B, et al. Mechanics of Hsp70 chaperones enables differential interaction with client proteins [J]. Nature structural & molecular biology, 2011 (3): 345-351.

[11]Rohde M, Daugaard M, Jensen MH, et al. Members of the heat-shock protein 70 family promote cancer cell growth by distinct mechanisms [J]. Genes & development, 2005 (5): 570-582.

[12]Fukushima C, Murakami A, Yoshitomi K, et al. Comparative proteomic profiling in squamous cell carcinoma of the uterine cervix [J]. Proteomics Clinical applications, 2011 (3-4): 133-140.

[13]Yoshidomi K, Murakami A, Yakabe K, et al. Heat shock protein 70 is involved in malignant behaviors and chemosensitivities to cisplatin in cervical squamous cell carcinoma cells [J]. The journal of obstetrics and gynaecology research, 2014 (5): 1188-1196.

[14]Dulin E, Garcia-Barreno P, Guisasola MC. Genetic variations of HSPA1A, the heat shock protein levels, and risk of atherosclerosis [J]. Cell stress & chaperones, 2012 (4): 507-516.

[15]Gabai VL, Mabuchi K, Mosser DD, et al. Hsp72 and stress kinase c-jun N-terminal kinase regulate the bid-dependent pathway in tumor necrosis factor-induced apoptosis [J]. Molecular and cellular biology, 2002 (10): 3415-3424.

(2016-05-08收稿，2016-08-15修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 刘华

The Association of SNPs inHSPA1AGene with Lung Cancer in Yunnan Han Population

ZHANG Xinwen1, LI Yingfu2, SHI Li1, MA Qianli3, HONG Chao1,WANG Tingting1, YU Jiankun1, LI Chuanyin1, YAO Yufeng1， YANG Huijuan1

(1.InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearch&DevelopmentonSevereInfectiousDisease,Kunming650118,Yunnan,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,Yunnan,China; 3.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To explore the association of four single nucleotide polymorphisms (SNPs) rs12190359 C>T, rs562047 C>G, rs1008438 G>T and rs1043618 G>C inHSPA1Agene with the lung cancer in a Yunnan Han population. Method: A total 288 patients with lung cancer and 298 healthy individuals were recruited in this study, and the genotyping of above-mentioned four SNPs was analyzed by Taqman assay. The distribution of alleles, genotypes and constructed haplotypes in the two groups was studied. Result: There were statistically significant differences in distribution frequency of alleles G and C of rs1043618 G>C were significantly different between case and control groups (P=0.038), and allel C was a protective factor of lung cancer[OR=0.767；95%CI(0.597～0.986)]. There were no statistically significant differences in distribution of the allele and genotype of rs12190359 C>T, rs562047 C>G and rs108438 G>T between the case group and control group(P>0.05). There were no statistically significant differences in the distribution frequencies of haplotypes of rs12190359 and rs1008438(G>T), rs562047(C>G) and rs11043618(G>C) between case and control groups (P>0.05). Conclusion: The C allele of rs1043618 G>C inHSPA1Agene may be a protection factor of lung cancer, and the other sites may be not related to occurrence occurrence of lung cancer.

lung cancer; HSPA1A; single nucleotide polymorphism; association; Han nationality; Yunnan province

国家自然基金项目(31270030和81573206)； 协和青年基金(3332015149)； 云南省应用基础研究重点项目(2016FA034)； 云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项(2013FB169)； 中国医学科学院病原生物学研究所基本科研业务费项目(2012IPB107)

E-mail:huijuanyang@imbcams.wm.cn

R734.2； RZ274

A

1000-2707(2016)09-1010-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.005

**

网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.032.html