周显飞， 田　舍， 王　杰， 贾亮亮， 喻　超， 江建新

(贵州医科大学附院 肝胆外科， 贵州 贵阳　550004)



·专题研究1·

microRNA-29c对人胰腺癌细胞侵袭转移的抑制作用及机制*

周显飞， 田舍， 王杰， 贾亮亮， 喻超， 江建新**

(贵州医科大学附院 肝胆外科， 贵州 贵阳550004)

目的： 探讨microRNA-29c对人胰腺癌细胞(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2)生物学特性的影响。方法： 培养1种人正常胰腺上皮细胞(HPDE)及4种人胰腺癌细胞(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2)，采用real-time PCR 法观察5种细胞系中microRNA-29c 的表达差异，以microRNA-29c过表达腺病毒感染的PANC-1 和MIA PaCa2细胞作为实验组，以空载体感染的PANC-1 和MIA PaCa2细胞作为阴性对照组，采用细胞划痕实验、Transwell法检测两组细胞体外侵袭能力，Western blot检测两组细胞上皮间充质转化(EMT)相关蛋白波形蛋白(Vimentin)及E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达。结果： real-time -PCR 显示各胰腺癌细胞系中microRNA-29c 水平明显低于正常胰腺细胞系(P<0.05)，细胞划痕实验发现感染腺病毒48 h后实验组PANC-1、MIA PaCa-2细胞的迁移距离明显短于阴性对照组(P<0.05)，Transwell 小室细胞侵袭实验发现实验组PANC-1 和MIA PaCa-2 细胞侵袭数量明显低于阴性对照组(P<0.05)；Western blot蛋白免疫印迹结果显示PANC-1 和MIA PaCa-2细胞过表达microRNA-29c后， Vimentin表达减少，E-cadherin表达增加。结论： microRNA-29c的过表达可有效抑制胰腺癌细胞的体外侵袭与转移，可能与Vimentin表达减少，E-cadherin表达增加有关，有望成为胰腺癌生物治疗的潜在靶点。

微小RNA； microRNA-29c； 胰腺癌； 腺病毒； 细胞侵袭； 转移； 细胞划痕实验

胰腺癌是恶性程度最高、预后最差的实体瘤之一，具有极为恶性的生物学特征，绝大部分患者(>85%)在确诊时已伴有局部和远处转移，从而导致患者的5年生存率极低(<5%)[1]。因此，更多地了解胰腺癌的发病机制对于胰腺癌的早期发现、诊断及治疗至关重要。microRNA是一类真核生物内源性小分子单链RNA, 长度通常为21～ 22个核苷酸, 能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对结合，从而对基因进行转录后表达的调控[2]。microRNA广泛参与机体发育、细胞增殖、细胞凋亡等一系列生物学过程，与肿瘤的发生、发展密切相关[3-5]，某些microRNA 通过抑制靶基因的表达，在肿瘤发生、发展及侵袭转移中发挥着关键作用[6-10]。microRNA-29c是microRNA-29家族中的一员[11]，其在众多实体肿瘤如鼻咽癌、神经胶质瘤、胃癌、肝细胞癌、膀胱癌及结肠癌中均呈低表达，作为抑癌基因存在，最近的研究发现，microRNA-29c在裸鼠模型中抑制胰腺癌肝转移并影响生存率[12]。本研究通过体外细胞实验分析microRNA-29c对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响，从而揭示microRNA-29c在胰腺癌细胞侵袭转移中的作用。

1　材料与方法

1.1细胞株及主要试剂

人正常胰腺上皮细胞HPDE，人胰腺癌细胞AsPC-1、BxPC-3、PANC-1及MIA PaCa-2获赠于华中科技大学附属同济医院胆胰外科实验室。胎牛血清购自gibico，RNA 抽提试剂TRIzol 购自Invitrogen 公司，逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaq 试剂盒均购自TaKaRa 公司。microRNA-29c 腺病毒过表达载体的构建、腺病毒包装与滴度检测由山东维真生物科技有限公司完成。microRNA-29c的逆转录引物及real-time PCR 引物套装购自广州锐博公司，E-cadherin、Vimentin、GAPDH一抗购自武汉三鹰有限公司，鼠抗和兔抗二抗购自博士德公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养胰腺正常上皮细胞HPDE，人胰腺癌细胞AsPC-1及BxPC-3用含10% 胎牛血清的RPMI1640 培养基培养；人胰腺癌细胞PANC-1及MIA PaCa-2用含10%胎牛血清的RPMI DMEM培养基培养；于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。

1.2.2microRNA-29c在胰腺癌细胞系中的表达用TRIzol试剂盒根据操作说明提取各细胞系细胞的总RNA，测定总RNA浓度，采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)各组胰腺癌细胞的表达，相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.2.3microRNA-29c腺病毒感染胰腺癌细胞将PANC-1 和MIA PaCa2细胞分别分为microRNA-29c感染组(实验组)和空载体组(阴性对照组)，根据腺病毒操作手册查得胰腺癌细胞PANC-1 和MIA PaCa2的慢病毒感染复数(MOI)值，取对数生长期细胞2 ×105个接种于6孔板中，待细胞贴壁后根据MOI值在实验组的PANC-1 和MIA PaCa2细胞加入适量的腺病毒液，培养箱中培养12 h后换液处理，根据后续实验需要进行相应处理。阴性对照组组则加入等量的空载体

1.2.4划痕实验感染腺病毒72 h后收集两组细胞，按第2天可长满12孔细胞培养板数量种于12孔细胞培养板中，待细胞长满培养板后准备划痕，更换无血清培养基分别培养，于0、24及48 h分别采用显微镜观察细胞的迁移情况，取4个视野尺寸进行数据统计。

1.2.5Transwell 侵袭实验感染腺病毒72 h后收集两组细胞,用无血清的培养基制成单细胞悬液，按1 ×108个/L 的细胞密度加200 μL 细胞悬液至已经铺好matrigel胶Transwell 上室中，下室加入含10%血清的DMEM 培养液800 μL，7 ℃孵育24 h 后，酒精棉球拭去上室未侵袭的细胞，经4%多聚甲醛固定30 min后,1%结晶紫染色30 min。采用显微镜观察细胞的侵袭情况，随机选取3个高倍(×100) 视野拍照计数。

1.2.6波形蛋白(Vimentin)及E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达Western blot法检测，感染腺病毒72 h后收集PANC-1细胞，使用BCA法测蛋白浓度后按50 μg上样量计算得出上样体积，SDS-凝胶电泳，孵育GAPDH(1∶10 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)一抗4 ℃摇床过夜，室温孵育二抗2 h后用ECL化学发光试剂曝光。

1.3统计学处理

2　结果

2.1microRNA-29c在人胰腺癌细胞株中的表达

microRNA-29c在PANC-1、BxPC-3、MIA PaCa-2及AsPC-1细胞的表达明显低于HDPE细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2microRNA-29c抑制胰腺癌细胞的侵袭和转移

Transwell 小室细胞侵袭实验结果显示:实验组PANC-1 和MIA PaCa2 细胞侵袭能力明显受到抑制，细胞侵袭数量明显少于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。细胞划痕实验发现，感染腺病毒48 h后实验组PANC-1、MIA 、PaCa-2细胞的迁移距离明显短于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

与HPDE比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01图1　microRNA-29c在HPDE、PANC-1、BxPC-3、MIAPaCa-2及AsPC-1细胞系中的表达Fig.1　Relative expression of microRNA-29c in HPDE, PANC-1, BxPC-3, MIA PaCa-2, AsPC-1 cells

(1)与阴性对照组比较，P<0.05图2　microRNA-29c 对PANC-1及MIA PaCa-2细胞侵袭能力的影响Fig.2　microRNA-29c inhibited PANC-1 and MIA PaCa-2 cell invasion ability

图3　microRNA-29c 对PANC-1及MIA PaCa-2细胞迁移能力的影响Fig.3　microRNA-29c inhibited PANC-1 and MIA PaCa-2 cells migration ability

2.3Vimentin及E-cadherin蛋白表达

Western blot实验结果显示，过表达microRNA-29c后，PANC-1细胞波形蛋白Vimentin表达减少，E-cadherin表达增加，提示microRNA-29c过表达抑制胰腺癌细胞的侵袭转移，见图4。

图4　microRNA-29c对PANC-1细胞中Vimentin及E-cadherin表达的影响Fig.4　microRNA-29c effect on Vimentin and E-cadherin expression in PANC-1 cell

3　讨论

肿瘤治疗失败的主要原因在于肿瘤转移，肿瘤细胞通过从原位突破基底膜进入血液或者淋巴循环，最后种植到远处器官。胰腺癌在癌症早期就极易发生远处的侵袭和淋巴结转移并且对传统的化疗药物耐药，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌的侵袭转移机制目前并不完全清楚，研究认为microRNA在胰腺癌中的表达异常对胰腺肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要影响。Moriyama 等[13]研究发现microRNA-21与MMP2/9或VEGF等侵袭转移相关基因在胰腺癌中的表达成正比，抑制microRNA-21的表达能起到抑制胰腺癌侵袭转移的作用，提示microRNA-21的表达失衡对胰腺癌的侵袭转移有重要的影响。microRNA-224和microRNA-486均能靶向调控CD40,抑制其在高侵袭转移的胰腺导管腺癌中表达，从而抑制胰腺癌侵袭转移[14]。研究发现胰腺癌细胞中的相关microRNA的异常表达与其侵袭转移相关。microRNA-29c在绝大多数肿瘤中低表达，前期研究发现，microRNA-29c在胰腺癌中低表达，而低表达的microRNA-29c可能与胰腺癌发生发展相关。

本研究通过腺病毒载体感染胰腺癌细胞获得高表达microRNA-29c的细胞株后，通过transwell实验模拟肿瘤细胞外环境，检测其侵袭转移能力，发现上调microRNA-29c表达水平后胰腺癌PANC-1及MIA PaCa-2细胞侵袭转移能力明显减弱，细胞划痕实验也同时证实上调microRNA-29c表达后胰腺癌PANC-1及MIA PaCa-2细胞迁移能力明显受到抑制。同时western blot对EMT相关蛋白表达水平进行检测，结果显示microRNA-29c上调胰腺癌细胞后，E-cadherin表达增多，Vimentin表达减少，证实了microRNA-29c能够抑制胰腺癌细胞的侵袭转移过程以及上皮间质转化过程，推测这可能与microRNA-29c参与调控肿瘤细胞EMT相关信号通路有关。

综上，本研究发现microRNA-29c的过表达可有效抑制胰腺癌细胞的侵袭与转移, microRNA-29c在胰腺癌中的调控可能为胰腺癌的基因诊断和生物靶向治疗提供新的思路，但microRNA-29c在胰腺癌中的具体作用机制需要进一步深入研究。

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(2016-05-23收稿，2016-08-24修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 赵毅

Study on microRNA-29c Inhibition Effect and Mechanism on Human Pancreatic Cancer Cells Migration

ZHOU Xianfei, TIAN She, WANG Jie, JIA Liangliang, YU Chao, JIANG Jianxin

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou，Chnia)

Objective: To investigate the effect of microRNA-29c on the biological characteristics of human pancreatic cancer cells(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2). Methods: Culturing 1 normal HPDE and 4 pancreatic cancer cells(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2). The different expression of microRNA-29c in human pancreatic cancer lines were observed by real time RT-PCR. microRNA-29c infected PANC-1 and MIA PaCa2 cells as experiment group, lip-null infected PANC-1 and MIA PaCa2 cells as negative control group; wound healing experiment, Transwell method to test the vitro invasion of both group cells; Western blot was used to measure the change of epithelial-mesenchymal transition (EMT) associated protein Vimentin and E-cadherin. Results: The result of real time RT-PCR showed that microRNA-29c expression in human pancreatic cancer cell lines were significantly lower than that in the normal pancreatic ductal epithelial cells (HPDE)(P<0.05); wound healing experiment discovered that 48 hr after infection, PANC-1 and MIA PaCa-2 cells in experiment group migrated obviously shorter than that of negative control group(P<0.05). TRanswell experiment discovered PANC-1 and MIA PaCa-2 cells in experiment group invasion number was obviously shorter than that of negative control group(P<0.05). Western blot indicated after overexpression microRNA-29c of PANC-1 and MIA PaCa-2 cells, Vimentin expression reduced and E-cadherin expression increased. Conclusion: The over-expression of microRNA-29c can effectively suppress the invasion metastasis human pancreatic cancer cells, indicating it might be a potential biological therapeutic target for pancreatic cancer.

micro RNA; microRNA-29c; pancreatic cancer; adenovirus； cell invasion; metastasis; wound healing experiment

国家国际科技合作专项资助(2014DFA31420); 国家自然科学基金资助项目(81160311)

E-mail:jjx731003@163.com

R735.9

A

1000-2707(2016)09-0997-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.002

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网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.024.html