张高丽，于海川

(1.河南省周口市中心血站　466000；2.新乡医学院医学检验学院　453003)



·论著·

精神分裂症样小鼠血液中miRNA-132的表达分析

张高丽1，于海川2

(1.河南省周口市中心血站466000；2.新乡医学院医学检验学院453003)

目的使用地卓西平马来酸盐(MK-801)腹腔注射制备精神分裂症小鼠模型，研究精神分裂症小鼠外周血中miRNA-132的异常表达情况。方法选取成年雄性昆明小鼠，随机分为注射生理盐水组(对照组)和注射MK-801组(实验组)，观察小鼠的行为学改变，用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各小鼠血液中miRNA-132的表达情况。结果(1)实验组小鼠刻板行为评分与对照组比较有显著增高(P<0.05)，自发活动增加显著，表现为直立数明显减少而走格数明显增多(P<0.05)，符合精神分裂症模型小鼠的表现。(2)与对照组相比，实验组miRNA-132表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)。结论miRNA-132在精神分裂症小鼠血液中有异常表达。

地卓西平马来酸盐;小鼠模型;精神分裂症;miRNA-132

精神分裂症是一组病因未明的、复杂的精神疾病，临床表现为感知、思维、情感、行为等方面的障碍，精神活动与环境的不协调为主要特征的一类最常见的、反复发作的慢性迁延性疾病。近些年，尽管对精神分裂症已经进行了大量的研究，但其准确的分子机制还未阐明。miRNA是一种非编码的单链小分子RNA，长度为19～24个核苷酸，在转录后其通过抑制基因表达调节几乎所有的生物过程[1]。研究表明，miRNA在转录后水平调控基因功能的失调，与神经精神障碍的起始和发生过程有着密切关系。本研究拟对昆明小鼠连续注射地卓西平马来酸盐(MK-801)制备精神分裂症样模型，观察小鼠行为学的改变，研究精神分裂症样小鼠外周血中miRNA-132的异常表达，进而探讨miRNA-132与精神分裂症的相关性，为深入研究精神分裂症的发病机制提供新的依据。

1　材料与方法

1.1实验动物昆明小鼠，成年，雄性，体质量20～30 g，由新乡医学院实验动物中心提供。于12 h昼夜节律下(8:00～20:00)笼养，保证动物饮水与进食自由，小鼠适应实验环境1周后将其随机分为注射生理盐水组的对照组和注射MK-801的实验组，每组各20只。

1.2方法将Sigma公司生产的MK-801溶于生理盐水中，实验组小鼠右后侧腹腔注射0.6 mg/kg，对照组小鼠右后侧腹腔注射等体积生理盐水，均连续注射7 d。

1.2.1MK-801诱导昆明小鼠精神分裂症模型的建立[2]实验组和对照组均于末次注射后10 min，开场实验评价小鼠自发活动能力和记录小鼠刻板性动作。

1.2.2开场实验参照文献[2]，开场实验箱(36 cm×36 cm×38 cm)，将底面划成16块相等的方格(9 cm×9 cm)，上方敞开。观察时轻提鼠尾将动物放在敞箱中央，每次测试10 min，记录小鼠自发活动能力(爬格数为观察期内昆明小鼠四肢爬过的格子数)。

1.2.3刻板性动作MK-801作用于昆明小鼠，产生类似精神分裂症的刻板性动作症状，如小鼠反复摇头、转圈、小范围内不停的无规则运动等。采用5分级评分，每10 min评分1次，观察2 h取其平均值。由3名不知情人员按评分表的要求进行盲法测评，以3名测评者评分的平均分纳入统计。

1.2.4标本采集与制备摘除眼球，颠倒试管2～3次，使血液与抗凝剂充分混匀。快速收集小鼠新鲜血液2～4 mL，放入含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，混匀后用低温冰箱2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1mL Trizol，室温放置5 min后提取总RNA。

1.2.5总RNA和反转录总RNA提取试剂由本实验室自配，按照总RNA快速提取步骤操作。miRNA反转录试剂盒(Takara公司,货号RR047A)按照说明书进行反转录反应。

1.2.6实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测仪器为Thermo公司，按照Takara公司试剂盒(货号DR037S)说明书操作。RT-PCR反应体系如下：cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.6 μL，Primer 10.2 μL，Primer 20.2 μL，2×Mix 5.0 μL。反应条件：95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40个循环，每个反应重复3次。

2　结　　果

2.1两组小鼠自发活动和刻板行为比较经MK-801诱导后的实验组小鼠自发活动增加。末次给药10 min后，与对照组比较，实验组的昆明小鼠直立数明显减少而走格数明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　　两组小鼠自发活动和刻板行为比较±s)

注：与对照组给药后比较，△P<0.05。

2.2实验组诱导模型小鼠刻板行为的表现MK-801可使昆明小鼠的行为出现明显异常。一般给药10 min后开始出现行为异常，20～60 min最明显，2 h后逐渐减弱。主要表现为反复摇头、转圈、小范围内不停地无规则运动等刻板性动作，与对照组比较，实验组刻板行为明显增多(P<0.05)，见表1。

2.3两组小鼠miRNA相对表达水平的比较与对照组相比，实验组中miRNA-432、miRNA-132、miRNA-181b表达水平显著下调，差异均有统计学意义(P<0.05)。miRNA-30a表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

注：与对照组比较，*P<0.05。

图1实验组与对照组miRNA的表达变化

3　讨　　论

MK-801是一种高亲和力的NMDA受体非竞争性拮抗剂，可以使模型小鼠模拟精神分裂症的阳性症状和阴性症状，从而导致小鼠认知能力下降。同时也可改变脑部及血液中部分miRNA的表达。实验结果表明，MK-801可以导致昆明小鼠产生类似精神分裂症的症状，且精神分裂症表现较明显，实验动物模型具有可重复性。

miRNA是在真核细胞中发现的，一类短的内源性非编码单链RNA分子，能够与特定mRNA靶点结合，调节蛋白质的翻译过程，进而调控基因的表达。有研究预测，人约有60%的蛋白基因表达受到miRNA分子的调节[3]。miRNA广泛存在于血浆和血清中，且在血浆和血清中非常稳定。由于小鼠脑组织标本不易获得miRNA，而血液miRNA检测相对简单可行，且在血液和脑组织中的miRNA表达具有一定的一致性，因此血液miRNA相关的研究也获得科学家的认可。本实验结果显示，与对照组相比，实验组中miRNA-30a表达水平上调，miRNA-432、miRNA-132、miRNA-181b表达水平下调。表明这4种miRNA可能与精神分裂症的发病机制存在相关性。miR-132是一种在神经和免疫方面起重要调节作用的miRNA[4]。Hansen等[5]的研究表明，CAMP反应元件结合蛋白可以调节miRNA-132，在成熟神经系统中miRNA-132的减少会导致突触异常，从而带来一系列与神经认知方面相关的疾病。Miller等[6]研究表明，精神分裂症中miRNA-132与神经发育和成人脑功能有密切关系，通过对100 例患者的研究中，发现与健康对照者相比，精神分裂症患者前额皮质层miRNA-132表达显著下降。这一结果与本研究发现的实验组血液中miRNA-132表达显著降低的结果相互吻合，说明miRNA-132不管在脑组织中还是血液中都可能成为精神分裂症生物标志物之一，具有很大的研究价值。

生物信息学技术的运用使得miRNA靶基因的预测有了很大进展。接下来本研究将收集偏执型精神分裂症的临床患者，进一步寻找及验证miRNA-132精神分裂症相关靶基因，并检测这些靶基因的表达情况，这将有助于揭示miRNA-132在调控精神分裂症发病和治疗中的详细分子机制，进而为深入研究精神分裂症的发病机制提供新的思路，甚至为最终治疗精神分裂症找到新的突破方向。

[1]Ding XC,Weiler J,Grosshans H.Regulating the regulators:mechanisms controlling the maturation of microRNAs[J].Trends Biotechnol,2009,27(1):27-36.

[2]Kuzmin A,Madjid N,Terenius L,et al.Big dynorphin,a prodynorphin-derived peptide produces NMDA receptor-mediated effects on memory,anxiolytic-like and locomotor behavior in mice[J].Neuropsychopharmacology,2006,31(9):1928-1937.

[3]Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136(2):215-233.

[4]Wanet A,Tacheny A,Arnould T,et al.miR-212/132 expression and functions:within and beyond the neuronal compartment[J].Nucleic Acids Res,2012,40(11):4742-4753.

[5]Hansen KF,Karelina K,Sakamoto K,et al.miRNA-132:a dynamic regulator of cognitive capacity[J].Brain Struct Funct,2013,218(3):817-831.

[6]Miller BH,Zeier Z,Xi L,et al.MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(8):3125-3130.

Analysis on blood miRNA-132 expression in schizophrenia mice

ZHANGGaoli1,YUHaichuan2

(1.ZhoukouBloodCenter,Zhoukou,Henan466000,China;2.SchoolofLaboratoryMedicine,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003,China)

ObjectiveTo prepare the schizophrenia mouse model by using peritoneal injection of dizocilpine maleate(MK-801),then to study the peripheral blood miRNA-132 abnormal expression in schizophrenia mouse model.MethodsAdult male Kunming mice(KM) were selected and randomly divided into the normal saline group(control group) and MK-801 group(experimental group).The behaviors changes were observed.Real-time PCR method was used to detect the miRNA-132 expression in peripheral blood.Results(1) Compared with the control group,the stereotyped behavior score in the experimental group was increased significantly(P<0.05),the spontaneous activity was increased significantly(P<0.05),showing that the up-right number was significantly decreased,while the walking-grid number was significantly increased(P<0.05),which was consistent with the manifestations of schizophrenia mouse model.(2)Compared with the control group,the miRNA-132 expressed in the experimental group was down-regulated,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionmiRNA-132 is abnormally expressed in blood of schizophrenia mouse.

dizocilpine maleate;mouse model;schizophrenia;miRNA-132

张高丽，女，主管技师，主要从事生物化学与分子生物学研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.014

A

1673-4130(2016)17-2394-02

2016-03-07

2016-05-15)