魏洁　胡刚　侯凤贤　甄永占　林雅军

[摘要]目的 探讨抗氧化复合酶对D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用。方法 将40只小鼠机分为4组：正常组、衰老模型组、低和高剂量复合酶组。除正常组外，小鼠每天背部皮下注射D-半乳糖100mg/（kg·d），给药组分别饮用相应剂量的复合酶溶液，其余组自由饮水，连续8周。检测小鼠血清和肾组织超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量；观察小鼠肾组织结构变化；检测衰老相关蛋白表达水平变化。结果 复合酶对小鼠体重没有影响。复合酶能够降低衰老模型引起的血糖和胆固醇升高（P<0.05）。与正常组比较，衰老模型组小鼠血清和肾组织SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量增加（P<0.05）；与衰老模型组比较，复合酶能够明显增加血清和肾组织SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量（P<0.05）。复合酶能够减轻衰老模型小鼠肾组织损伤和调控衰老相关蛋白的表达。结论 复合酶能够提高活性氧自由基的清除率，减轻机体损伤，延缓衰老。

[关键词]复合酶；D-半乳糖；抗氧化；肾组织；衰老

[中图分类号]R965.1 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）02-14-05

50多年前Harman提出了衰老的自由基理论，他认为衰老是自由基对细胞成分和结缔组织损伤的结果。这些自由基来自氧化酶催化的分子氧相关反应。自由基清除剂可直接或间接清除体内过多的自由基，有效阻止或防止由于过多自由基而导致的氧化损伤，起到保护机体延缓衰老的作用。因此，开发与研究抗氧化剂具有重要的意义。正常机体中存在针对R0s介导细胞损伤的抗氧化防御系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）。其中超氧化物歧化酶（SOD）在机体抗氧化系统中扮演着重要角色，其能够将细胞内超氧阴离子（O-）还原成HO。接下来谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）把H2O，代谢成O2和H2O。在病理条件下，如D-半乳糖衰老模型，机体的抗氧化能力会降低。因此有必要补充抗氧化酶或使用氧自由基清除剂。复合酶是辽宁未来生物科技有限公司采用具有国际先进水平的封闭式生物萃取技术，从玉米胚芽中提取SOD、GSH-Px和CAT三种主要成分研制而成。每100克玉米胚芽提取物含有SOD 378800u、GSH-Px 288000u和CAT17800u。本实验在D-半乳糖衰老模型小鼠体内观察了复合酶的抗衰老作用。

1.材料与方法

1.1动物

ICR系成熟小白鼠，体重（20.0±2.0）g，雌雄各半，北京维通利华动物中心提供，合格证：SCXX（京）2002-0003。

1.2药物与试剂

复合酶由辽宁未来生物科技有限公司提供；D-半乳糖、H&E染色试剂盒和RIPA组织裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯检测试剂盒由北京瑞正善达生物工程技术有限公司提供；SOD、GSH-Px和MDA试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；10%水合氯醛北京医院制剂室提供；蛋白酶抑制剂套装购自sigma公司。抗SIRTl、FOX03a、p53、p21和B-actin抗体购自细胞信号通路公司。

1.3实验仪器

酶标仪（SpectraMax 190）由美国MolecularDevices公司生产。奥林巴斯显微镜CK40由日本奥林巴斯公司生产。日立7100型全自动生化分析仪由日本日立公司生产。凝胶成像仪购自美国alpha公司。

1.4方法

1.4.1动物分组、造模和用药 将40只小鼠按体重随机分为4组（每组10只）：正常组、衰老模型组、低剂量复合酶组[13g/（kg·d）]和高剂量复合酶组[26g/（kg·d）]。除正常组外，其余各组小鼠每天背部皮下注射D-半乳糖100mg/（kg·d），持续8周，正常组小鼠每天皮下注射等量的生理盐水，低、高剂量复合酶组分别饮用40mg/mL和80mg/mL的复合酶饮料（假定20g小鼠每天饮水6mL，推算的饮料中复合酶浓度）。正常组和衰老模型组自由饮水，连续8周。

1.4.2观察实验期间动物行为、饮食、饮水变化 每2周观察小鼠体重变化；实验结束时，用10%水合氯醛麻醉小鼠，下腔静脉采血，收集血清。检测血清葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、总胆固醇（CHOD-PAP法）和甘油三酯（GPO-PAP法）含量。

1.4.3SOD、GSH和MDA含量检测 实验结束时，用10%水合氯醛麻醉小鼠，下腔静脉采血，收集血清。处死小鼠，取肾组织，制备肾组织匀浆后收集上清液，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性、二硫代二硝基苯甲酸直接法检测GSH-Px活性、硫代巴比妥酸法检测MDA含量。

1.4.4小鼠肾组织形态学观察 取各组小鼠的肾脏标本，经10%中性福尔马林溶液固定后，常规石蜡包埋，制作成4um石蜡切片，分别进行苏木素一伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H&E），观察肾组织学改变。

1.4.5Western blot检测蛋白表达水平 每组各取50mg-80℃冻存的小鼠肾组织标本，置于RIPA+sigma公司蛋白酶抑制剂中裂解，冰浴下匀浆，离心，取上清液BCA法测定蛋白浓度后制成蛋白含量相等的样品，每孔上样25uL，进行SDS-PAGE电泳。经300mA湿转3h后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，然后滴加SIRTl、FOX03a、p53、p21和B-actin一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3遍，二抗室温孵育1h，TBST洗膜3遍，膜上滴加化学发光增强剂（Santa Cruz Biotechnology SC-2048），按照试剂说明进行操作，结果在凝胶成像仪上照相。

1.5统计学分析