潘文，汪乐原

(1、湖北中医药大学 药学院，湖北 襄樊 441000；2、湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065)

一个湖北麦冬疑似种的分类地位研究△

潘文1，汪乐原2*

(1、湖北中医药大学 药学院，湖北 襄樊 441000；2、湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065)

目的：为一个湖北麦冬疑似种的命名及其药用价值的研究提供基础。方法：对湖北麦冬疑似种及从形态或分布上看较有可能是其亲本或原变种的植物，还有不可能是其亲本或原变种但与其区别最小的湖北麦冬，进行ISSR，将ISSR的结果转换成由0和1组成的数据矩阵，用软件SPSS16.0计算处理这种数据矩阵，以得到任意两个供试植物的相关系数，并构建聚类图。根据对相关系数和聚类图的分析结果，作出研究结论。结果：从52个ISSR引物筛选出10条引物，这10条引物共扩增出141条带，其中140条是多态性的，能很好的区分各种供试植物。湖北麦冬疑似种与湖北麦冬间的相关系数，大于湖北麦冬疑似种与其他供试植物间的相关系数；湖北麦冬疑似种与山麦冬间相关系数的平均数，小于湖北麦冬疑似种与湖北麦冬间相关系数的平均数，大于湖北麦冬疑似种与剩余的其他种供试植物间的相关系数或相关系数的平均数。聚类图也显示，湖北麦冬疑似种先与湖北麦冬聚类，次与山麦冬聚类，然后才与其他的供试植物依次聚类。结论：湖北麦冬疑似种可能是山麦冬中的(同源四倍体)与短葶山麦冬(二倍体)杂交而产生的异源三倍体。这样推测的依据是：1、此种植物与湖北麦冬间的相关系数最大，并且都具有开花后不结果的特征，而周群等人对湖北麦冬的核型研究表明，它是一种异源三倍体；三倍体又恰好早被遗传学阐明是不能进行有性生殖的。2、湖北麦冬疑似种和短葶山麦冬都没有地下横走茎，并且两者之间的相关系数是第三大的。3、湖北麦冬疑似种与山麦冬间的相关系数是第二大的，并且两者的花药在形态上都是矩圆形范畴的。

湖北麦冬疑似种；分类；ISSR

2010年和2011年，笔者先后在武汉市的汉口常青公园发现31株、在汉阳的龟山北坡发现27株、在武昌的湖北中医药大学紫阳校区发现18株湖北麦冬LiriopespicataLour.var.proliferaY.T.Ma的疑似种。说是湖北麦冬疑似种的理由为：此种植物的大多数性状都与湖北麦冬的一样，尤其是其花序也像湖北麦冬的花序那样，开完花后不结果而生出叶簇。但其不像湖北麦冬那样具地下走茎，且其花药比湖北麦冬的花药宽一点(其花药呈矩圆形[1]，而湖北麦冬的花药呈狭矩圆形[2])。

由遗传学的理论知道，开花后不结果的植物不可能是正种(或称原变种)，而很可能是某个正种的变种或某两个不同正种的杂交种[3]。上述的湖北麦冬疑似种究竟是湖北麦冬还是后者所在属即山麦冬属(Liriope)的某个正种的变种？或者是此属某两个正种间的杂交种？笔者对这样的问题很感兴趣，因为笔者知道，山麦冬属的已知植物都会生出块根，其块根大多有药用功能[4-5]；开花不结果的植物所生出的地下部分一般产量较高，若含药用成分，其含量也会较高。湖北麦冬疑似种肯定是山麦冬属植物，由于它与湖北麦冬一样也生有块根和开花后不结果，因此它很可能与湖北麦冬一样是此属中块根产量较高的药用植物。如果经研究证明，它也是湖北麦冬，那么由于它不像具地下走茎的湖北麦冬那样被人类长期精心栽培，因此很可能在抗逆性上比湖北麦冬强。如果经研究证明它不是湖北麦冬，而是同属的某个种的变种或某两个种间的杂交种，那么就可以给其命名，之后就可以名正言顺地研究其药用品质和价值。则有利于给其命名。为了找到上述问题的答案，笔者用ISSR(简单序列重复区间扩增多态性)技术进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

见表1中所列。材料的鉴定人是本文作者之中的汪乐原教授，材料采回后分别栽培于各个花盆里。

表1 材料名称及产地

注：之所以称表1中的7号材料为疑似川麦冬，是因为笔者遇到它时，它既未开着花也未挂着果，以至无法鉴定；但笔者看到它与川麦冬一样具细长的地下走茎，且生于川麦冬的著名产区——四川省绵阳市三台县。此材料不是本研究课题所需要的材料，是为其他目的而顺便试验的材料。

1.2 方法

1.2.1 植物基因组DNA的提取 取上述材料的新鲜叶片，洁净后在液氮中研成粉末，再用上海捷瑞生物工程有限公司出品的植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，按下述方法对之进行提取：

(1)从叶片粉末中取适当量，快速转移置1.5 mL的离心管中。(2)加入400 μL的PCL Solution，震荡混匀1分钟，再加入15 μL的RnaseA，充分混匀。置于65 ℃水浴15～30 min，其间颠倒混匀2次，直至混合液变透明。(3)12 000 rpm离心5 min，轻轻吸取上清液到干净的离心管中。

(4)加入150μL的PPSolution，上下颠倒3～5次，在冰上放置15 min.

(5)12 000 rpm 离心5 min.轻轻吸取上清液到新的干净的离心管中。

(6)加入600 μL的PB Solution，混匀，室温静置3 min。

(7)取全部混合液到GenCleanColumn 中，12 000 rpm离心3 min，取下GenClean Column，倒掉收集管中废液(注：如果混合液量较大，则分两次过柱)。

(8)将GenCleanColumn 放回收集管中，然后加入500 μL的Wash Solution，12 000 rpm离心30 s。(9)重复第(8)步骤一次。(10)取下GenCleanColumn，弃去收集管中的废液，将GenCleanColumn放回收集管中，12 000 rpm离心1 min。(11)将GenCleanColumn在室温下开盖放置5 min，或在50℃下放置2 min，以彻底去尽残留的乙醇。(12)将GenCleanColumn放入干净的1.5 mL离心管中，在GenCleanColumn的中央加入30～50 μL Elution Buffer，室温或55 ℃下放置2 min，12 000 rpm离心1 min，完毕后离心管中出现的液体即为基因组DNA。

1.2.2 对提取物进行ISSR 反应体系的总体积为20 μL，其中含有10 x Buffer2.0 μL，Tag聚合酶(购自天根生化科技有限公司)0.5 μL，25 mmol·L-1的M2+2.0 μL，引物0.96 μL，10 mmol·L-1的dNTPs1.2 μL，模板DNA2.0 μL，甲酰胺0.4 μL，ddH2O10.94 μL。在PTC-200(德国BIO-RAD)PCR仪上进行扩增，具体程序为：先在95 ℃下预变性3 min，然后把在94 ℃下变性30 s、在50 ℃下复性45 s和在72 ℃下延伸90s这三步循环进行40次，最后在72 ℃下延伸5 min。结束了扩增反应，则取扩增产物7μL与核酸染料3μL混匀，加入到预先制好的1%琼脂糖凝胶的点样孔中，在5 V/cm的电压下用1×TAE电泳缓冲液电泳100 min。

1.2.3 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及检测 取扩增产物7 μL，与3 μL核酸染料混匀，加入到预先制好的1%琼脂糖凝胶的点样孔中，在5 V/cm的电压下用1×TAE电泳缓冲液电泳100 min。电泳结束后，在WD-9413A 凝胶成像分析仪(北京六一仪器厂)上观察扩增产物电泳带并对之拍照。

1.2.4 数据处理 将肉眼可见的每个电泳带都记为1，将这些1按所对应的引物的不同分为不同的组，每个组中的1以相应的样品为对口，以带间的迁移率之差为间距，排成一个纵列，组中各样品的具有同样迁移率的1排在同一条水平线上；若有的样品在这种水平线上没有1，则给其记个0在这种水平线上。通过这样的方法建立二元数据矩阵，然后使用SPSS16.0软件中的Jaccard方法对数据矩阵进行聚类分析，以获得各样品间的相关系数表和聚类图。

2 结果

2.1 有效引物及其扩增情况

通过对52个ISSR引物(美国哥伦比亚大学公布，上海捷瑞生物工程有限公司分装)进行筛选，选得10个能使各样品扩增出多态性高并且清晰、稳定之条带的引物，其碱基序列见表2。

表2 10个有效引物的碱基序列

在这10个引物中，扩增条带最多的是引物UBC850，为17条，见图1，扩增条带最少的是引物UBC856，为11条。

注：M是Marker，1至15是各样品的编号，它们与表1中各材料的编号相对应图1 引物UBC850对各样品的扩增谱带

10条引物共扩增出141条带，其中140条是多态性的，见表3。

表3 10个有效引物的扩增情况

2.2 ISSR的分辨率表现

10个有效引物的扩增带型均有变化，能很好的区分各种供试植物。

2.3 处理数据后获得的样品间相关系数表和聚类图见表4和图2。

3 讨论

表4 样品间相关系数表

图2 所有供试样品的聚类图

聚类图显示，产区不同而学名相同的植物之间优先聚类，仅武昌或庐山产的短葶山麦冬(即4号或5号材料)与泉州产的短葶山麦冬(即6号材料)之间是例外；从相关系数表中也可以看出，产地不同而学名相同的植物，其间的相关系数大于其跟非同名植物间的相关系数(仅庐山或武昌产的短葶山麦冬与泉州产的短葶山麦冬之间是例外)，这些都部分地证明，当初笔者对供试材料的鉴定结论是正确的。

从相关系数表中还可以看出，湖北麦冬疑似种(13和14号材料)与湖北麦冬(3号材料)间的相关系数为0.373和0.415，均大于湖北麦冬疑似种与其他供试植物间的相关系数；湖北麦冬疑似种与山麦冬间的相关系数为0.299、0.306、0.323和0.333，其平均数是0.315，此数小于湖北麦冬疑似种与湖北麦冬间相关系数的平均数，大于湖北麦冬疑似种与其他任何种供试植物间的相关系数或相关系数的平均数。聚类图也显示，湖北麦冬疑似种先与湖北麦冬聚类，次与山麦冬聚类，然后才与其他的供试植物依次聚类。这些情况表明，湖北麦冬疑似种与湖北麦冬的遗传距离最近，与山麦冬的遗传距离第二近。

湖北麦冬疑似种可能是山麦冬(同源四倍体)与短葶山麦冬(二倍体)杂交而产生的异源三倍体。这样推测的依据是：(1)此种植物与湖北麦冬间的相关系数最大，并且都具有开花后不结果的特征，而周群等人对湖北麦冬的核型研究表明，湖北麦冬是一种异源三倍体[6]；三倍体又恰好早被遗传学证明是不能进行有性生殖的。(2)此种植物和短葶山麦冬都没有地下横走茎，并且两者之间的相关系数是第三大的。(3)此种植物与山麦冬间的相关系数是第二大的，并且两者的花药都是矩圆形的。或许有人会质疑：此研究中试验的山麦冬属植物未包括该属在中国的全部种类，尚缺乏矮小山麦冬、长梗山麦冬和甘肃山麦冬这三种，怎么可以根据对有限的种类进行试验所获得的结果，作出“湖北麦冬疑似种可能是山麦冬中的同源四倍体类型与短葶山麦冬(二倍体)杂交而产生的异源三倍体”这一判断呢？笔者的回答是，那三种未被试验的山麦冬属植物有着与无学名植物明显不同的自然分布区(而本研究中的各供试植物有相同或基本相同的自然分布区)，故那三种植物不会是无学名植物的原变种或亲本种。既然如此，那么就可以作出“湖北麦冬疑似种可能是山麦冬(同源四倍体)与短葶山麦冬(二倍体)杂交而产生的异源三倍体”这一判断。

当然，这一判断还不等于说湖北麦冬疑似种就是山麦冬(同源四倍体)与短葶山麦冬(二倍体)杂交而产生的异源三倍体。只有当以后用其他技术(如核型分析技术和蛋白质电泳技术)再对上述材料进行试验后，所得的结果也支持“湖北麦冬疑似种可能是山麦冬(同源四倍体)与短葶山麦冬(二倍体)杂交而产生的异源三倍体”这一判断时，才可以说：湖北麦冬疑似种就是山麦冬(同源四倍体)与短葶山麦冬(二倍体)杂交而产生的异源三倍体。

[1] 汪乐原，潘文.湖北麦冬的分类问题与一种无学名植物的识别[J].湖北中医药大学学报，2012，14(1)：80.

[2] 中科院中国植物志编委会.中国植物志：15卷[M].北京，科学出版社，1978：123-126.

[3] 杨业华.普通遗传学[M].北京，高等教育出版社，2004：149-158.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京，中国医药科技出版社，2010：25.

[5] 余伯阳.中药麦冬类的粉末显微特征研究[J].中国药科大学学报，1992，23(1)：5.

[6] 周群，邹建丘，陈家春.山麦冬属2种药用植物的染色体核型分析[J]，湖南中医药大学学报，2007(27)：295-296.

StudyonTaxonomyofASuspectedLiriopespicatavar.prolifera

PAN Wen1，WANGLeyuan2*

(1.CollegeofPharmacyHubeiUniversityofChineseMedicine，Xiangfan441000，China；2.CollegeofPharmacyHubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China)

Objective：To provide a ground for nomination of a kind of suspectedLiriopespicatavar.proliferaand study of medicinal value of the plant.Methods：Genetic relationship of the tested materialsis analyzed with ISSR marker.The materials consist of the kind of suspectedL.spicatavar.prolifera，some plants that any of them is possible to be the foemer’sprotovariety or parent in view of morphology and distribution，andL.spicatavar.proliferawhich is not possible to be the foemer’sprotovariety or parent but seems to be most similar to the former.The results of ISSR is converted into 0/1 to obtain the correlation coefficients of the tested plants and construct the matrixes.The matrixes were processed with the SPSS 16.0 in order clustering dendrogram.Results：10 available primers were screened from 52 ISSR primersand 141 DNA bands were amplified，of which 140 were polymorphic.The correlation coefficient between the suspected Liriopespicata var.prolifera andL.spicatavar.proliferaislarger than the correlation coefficient between the suspectedL.spicatavar.proliferaand other tested plant.Average number of the correlation coefficient between the suspectedL.picatavar.proliferaandL.spicataless than average number of the correlation coefficient between the suspected Liriopespicata var.prolifera andL.spicatavar.prolifera，and except the three species，larger than average number of the correlation coefficient between the suspectedL.spicatavar.proliferaand the rest tested plants.Similarly，the clustering dendrogramshows that firstly the suspectedL.spicatavar.proliferaandL.spicatavar.proliferatogether，then andL.spicatatogether.Conclusion：This suspectedL.spicatavar.proliferamay be allotriploid produced in the hybrid betweenL.spicata(tetraploid type)andL.muscari(diploid).The basis for such speculation is：1.the correlation coefficient between the plant andL.spicatavar.proliferais the largest，and these two plants all have the characteristics of non outcome after flowering，and the study on karyotype ofL.spicatavar.proliferaby Zhou Qun et al. showed that it is a kind of allotriploid；exactly，triploid plants have long been proved by genetics that they are incapable of sexual reproduction.2.this suspectedL.spicatavar.proliferaandL.muscariare no underground creeping stems，and the correlation coefficient between these two plants is the third largest.3.the correlation coefficient between this suspectedL.spicatavar.proliferaandL.spicatais the second largest，and anthers of these two plants are oblong.

Liriopespicatavar.prolifera；taxonomy；ISSR

2015-07-02)

湖北省卫生厅中西医结合课题

*

汪乐原，教授，研究方向：中药资源与品质；Tel：(027)68890106，E-mail：2791779976@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.019