高晓霞，徐荣，陈君，于晶，杨成民，刘赛，张永清，彭艳丽*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193)

不同种质黄芩中黄酮类成分测定及分析△

高晓霞1，2，徐荣2，陈君2，于晶2，杨成民2，刘赛2，张永清1，彭艳丽1*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的：对不同种质黄芩中3种黄酮类成分和总黄酮进行测定和综合评价，为遴选黄酮类成分含量高的黄芩种质提供依据。方法：采用改进的高效液相色谱法测定不同种质黄芩根中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量，采用UV-可见分光光度法测定总黄酮含量，应用主成分分析和灰色模式识别法验证并综合评价不同种质黄芩的化学质量。结果：黄芩苷、汉黄芩素及总黄酮含量在不同种质间差异显著，其中13号黄芩种质黄芩苷和总黄酮含量最高，1号、7号黄芩种质黄芩苷、黄芩素与总黄酮含量均较高。主成分分析和灰色模式识别法分析结果验证了本次试验中1号、7号、13号为优良种质，可以作为黄芩新品种选育对象。结论：采用改进后的HPLC法可较好地测定黄芩3种黄酮类成分，不同种质黄芩中黄酮类成分含量均存在显著差异；应用主成分分析和灰色模式识别法均遴选出了目标种质，该方法适用于不同种质药材质量的综合评价。

黄芩；黄酮类成分；主成分分析；灰色模式识别法

黄芩为唇形科多年生草本植物，以根入药，为我国常用中药，历代本草均有收载，主产于华北、东北、西北等地区。现代药理研究证明，黄芩中有效成分主要为黄酮类成分，其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素在抗氧化、抗炎、抗变态、抗菌、抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等方面具有显著作用[1-2]。近年来以黄芩苷为主要原料的针剂、片剂、口服液等中成药相继投产，在国际、国内市场热销，随着黄芩应用范围的扩大，其需求量逐年增加，呈供不应求之势，据全国中药资源普查统计，山东每年提取厂用量为2.2万t鲜药材。

目前人工栽培的黄芩多来自野生种源，种质类型多样，针对其需求选育不同目标的黄芩优良品种对稳定和保证药材质量具有积极意义。研究证明，中药发挥药效作用是通过多成分作用多个靶点实现的，对中药某一“有效指标成分”的定量分析并不能完全表现出药材的内在品质。本文采用反高效液相色谱法同时测定了14份不同种质黄芩药材的多个黄酮类成分[3]，并应用主成分分析和灰色模式识别法进行综合评价，为黄芩药材的质量评价及新品种选育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

14份黄芩来自于早期课题组从山东、河北、宁夏、大连、北京等地收集的黄芩种质(表1)，经去杂纯化、扩繁后开展种质评价和比较。本研究的14份黄芩样品2013年6月扦插繁殖于药用植物研究所栽培试验地，每份种质分别移栽种植于3个小区，2014年11月3日黄芩枯叶后分别采挖其地下根部，每份种质取样15株，3个重复。60 ℃烘干后粉碎，过40目筛，待测。

表1 不同种质黄芩收集信息

1.2 仪器与试剂

仪器：waters 2690高效液相色谱仪，Waters 996紫外检测器，UV-2550型紫外-可见分光光度计，电子分析天平FA2004，精确到0.1 mg，DHG-9143BS-III型的电热恒温鼓风干燥箱，KQ-250DE型数控超声机，HH-S8数显恒温水浴锅，台式高速离心机TG16MW。

试剂：乙醇为分析纯，甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，水为超纯水，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品均购于中国药品生物制品检定所。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 采用PUROSPHER® RP-18 endcapped(250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱，以甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%磷酸水(C)为流动相[4-8]，梯度洗脱程序为：0-10 min，A-B-C(38∶12∶50)；10～30 min，A-B-C(38∶12∶50→80∶10∶10)；30～35 min，A-B-C(80∶10∶10)；35～40 min，A-B-C(80∶10∶10-38∶12∶50)；每针进样分析完毕后用初始流动相组成平衡5 min后再进行下一针分析。流速为1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，紫外检测波长为277 nm；进样体积为10 μL，用waters2690工作站采集数据并分析。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品各4.68、2.98、3.09 mg先配制成一定浓度的对照品储备液，再分别各自取适量到10 mL的容量瓶内配制成混合标准对照溶液。

1.3.3 供试品溶液的配制 称取0.100 0～0.110 0 g黄芩干燥药材(含水量均在4%左右)过40目筛的粉末，加50 mL 50%乙醇溶液，精密称定，60 ℃、100 Hz超声30 min，放至室温，用50%乙醇补足差重，过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液[4，9-10]。

1.3.4 线性关系考察 精密吸取“1.3.2”项下的混合对照品溶液，以4、8、10、12、16、20 μL的体积按照“1.3.1”项下的色谱条件进样测定，以峰面积A为纵坐标Y，以进样量M(μg)为横坐标X，绘制标准曲线，得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的回归方程见表 2。

表2 黄芩药材中3个化学成分的标准曲线方程、相关系数和线性范围

1.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在2、4、6、10、12、14、18、20 h进样10 μL，测得黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为3.3%、3.4%、3.3%。结果表明供试品溶液中上述3个成分在20h内稳定性良好。

1.3.6 精密度试验 按照“1.3.3”项制备供试品溶液，以10 μL连续进样6次。测得上述3个成分的峰面积RSD分别为1.4%、1.5%、1.4%，结果表明该仪器的精密度良好。

1.3.7 重复性试验 取同一黄芩样品5份，按照“1.3.3”项制备供试品溶液，以10 μL进样测定。结果显示上述3个成分的峰面积RSD分别为1.4%、4.3%、2.3%，符合规定。

1.3.8 回收率试验 取已知含量(黄芩苷14.93%、黄芩素1.159%、汉黄芩素0.334 7%)的黄芩粉末样品6份，按照“1.3.3”项制备供试品溶液，分别精密吸取样品提取液1 mL、混标溶液1 mL于5 mL容量瓶中并定容[11-12]，以10 μL进样测定，计算回收率，以上3个成分的平均回收率分别为98.2、%、102.3%、96.5%，RSD分别为1.65%、3.19%、3.41%。

1.3.9 总黄酮的测定 采用紫外—可见分光光度法测定[13-14]，取“1.3.3”项的供试品溶液适量，4800 r/s的转速离心8分钟，取100 μL上清液于10 mL的容量瓶(经浓度梯度考察样品吸收度A值均在0.2～0.7范围内)，用50%乙醇溶液定容后测定吸收度，全波长扫描结果显示在280 nm处有最大吸收，故确定紫外吸收波长为280nm。

精密称取黄芩苷对照品3.34 mg于10 mL容量瓶中用甲醇配制成标准对照品储备液，分别吸取85、240、400、540、700、850 μL的对照品储备液于25 mL的容量瓶中配制成不同浓度梯度的对照品溶液，经线性回归分析得到吸收度Y(A)和浓度X(C，mg·mL-1)的回归方程Y=71.568X-0.003，r=1.000，经方法学考察结果均符合规定，表明此方法准确可靠。

2 结果与分析

2.1 样品含量的测定

按照上述高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法分别测定不同种质黄芩黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和总黄酮的含量，方差分析结果见表3、4。

表3 不同种质黄芩药材黄酮类成分的含量比较(n=3)及评价

注：采用Duncan s multiple range test方法分析，同一列不同字母表示显著性差异(P<0.05)。

表4 不同种质黄芩黄酮类成分方差分析及变异系数

注：表中*表示差异达显著性(P<0.05)；**表示差异达极显著性(P<0.01)。

从方差分析可知，黄芩苷、汉黄芩素、总黄酮在不同种质间差异显著，在区组间差异不显著，遗传比较稳定，受环境影响小；其中13号的黄芩苷和总黄酮含量均为最高，1号、7号种质的黄芩苷、黄芩素及总黄酮含量均较高；黄芩素种间差异不显著，但在区组间的差异达极显著，表明黄芩素遗传稳定性差，受环境因素影响较大，不适宜作为选种依据。

从变异系数[15-18]来看，黄芩苷和总黄酮在区组间的变异系数较小(分别为6.61%和5.08%)，进一步说明黄芩苷和总黄酮含量稳定，受环境因素影响小。而黄芩素和汉黄芩素在种源间和区组间变异系数均较大，说明二者种质间差异大，且遗传稳定性较差。

2.2 主成分分析

试验中不同种质黄芩的4个化学成分含量指标的主成分分析的特征值如表5所示。特征值≥1的主成分有2个，累积方差贡献率达80.4%(一般大于70%为宜[19])。由于主成分是原始性状的线性组合函数，根据计算样本相关矩阵的特征向量(表5)可给出主成分的函数式为：

F1=0.57X1-0.12X2-0.55X3+0.60X4

F2=-0.23X1+0.97X2+0.03X3-0.01X4

由函数式看出，在第一主成分Z1中，总黄酮含量X4的系数最大，其次是黄芩苷X1的系数也较大，表明第一主成分主要是反映黄酮总含量的综合指标，第二主成分Z2中，黄芩素含量X2的系数最大，表明第二主成分是反映黄芩素含量的综合指标。

表5 黄芩主要化学成分含量主成分分析的特征值和特征向量

比较不同种质黄芩的各化学成分含量的主成分得分，见图1可知，3号、6号、13号种质的Z1值较大，结合表3中的标准偏差可知，3号的总黄酮含量和6号的黄芩苷含量个体间取样偏差较大，即最终判定13号的黄芩苷(或总黄酮)含量较高，适合作为黄芩提取物原料来源的黄芩种质；11号的Z2值较大，但表3中其黄芩素的标准偏差较大；位于第一象限对角线左右的1号、7号种质的Z1和Z2均为正值，且Z2/Z1值较接近于1，表明黄芩素与黄芩苷(或总黄酮)不仅含量高，且贡献比例相当，这与临床用药安全规范中黄芩素与黄芩苷含量比值规定有一定的联系，故推测这2份黄芩种质适合用于临床中药饮片或中成药原料；位于第一象限的8号种质Z2得分稍较高，属于黄芩素含量高的种质类型，但Z1得分较低，即药典规定质量指标黄芩苷含量不高；其余种黄芩源主成分得分值特征性不强。

2.4 灰色模式识别法验证——综合评价黄芩药材质量

2.4.1 选择参考序列 上述一共有14份样品，每份样品有4项评价指标，则组成的评价单元序列为{Xij}(i=1，2…14；j=1，2，3，4)。其中最佳参考序列{Xsj}为14份样品对应指标的最大值，最差参考序列{Xtj}为14份样品对应指标的最小值[20]。

2.4.3 计算关联系数 相对于最优参考序列关联系数如下：

其中，Δmin=min|Yij-Ysj|，Δmax=max|Yij-Ysj|，ρ为分辨系数，取值为0.5[21]。

相对于最差参考序列关联系数如下：

其中，Δ′min=min|Yij-Ytj|，Δ′max=max|Yij-Ytj|，ρ为分辨系数，取值为0.5。

2.4.4 计算关联度

图1 不同种质黄芩化学成分主成分分析的得分值坐标分布图

相对于最优参考序列关联度：

相对于最差参考序列关联度：

2.4.5 计算相对关联度Ri(s)越大，表明评价单元序列相对于最优参考序列的关联度越大，评价单元越佳；反之，Ri(t)越小，评价单元越好。故定义评价单元序列{Xij}同时相对于最优参考序列{Xis}和最差参考序列{Xit}的相对关联度为

对于不同种质黄芩各黄酮类成分含量数据进行关联度分析，结果见表3中Ri值，以Ri值进行种质优良排序可知，7号、1号、5号、13号和8号依次排在前五位，若选择Ri值在0.535以上为优良种质[20]，则从化学质量角度认为1号、5号、7号和13号为化学质量优良的黄芩种质。此结果与上述主成分分析结果高度一致，验证了分析结果的准确性。此外，5号种质化学质量综合评价排名靠前，但其总黄酮含量个体间偏差较高(见表3)，前期性状调查结果也表明其外观形态性状层次不齐、产量性状一般，所以即使化学质量稍好，也不具备优良种质的条件。因此1号、7号、13号种质在化学质量综合评价之后结合前期性状调查结果，可作为黄芩新品种选育对象。

3 结论与讨论

本试验在已报道方法的基础上略加改进的色谱条件能使所需测定的化学成分很好地分离。通过种质间和区组间方差分析及变异系数比较，发现不同种质黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩素及总黄酮含量差异显著；而黄芩素在区组间差异达极显著性，表明其受环境因素影响较大；黄芩苷和总黄酮在区组间和种源间的变异系数均小于黄芩素和汉黄芩素，表明黄芩苷与总黄酮的遗传稳定性较好，提示在黄芩品种选育时，可以独立选择遗传稳定性好的黄芩苷(《中华人民共和国药典》规定黄芩苷为限定指标)或总黄酮作为化学质量评价指标。

化学成分灰色模式识别法不宜独立评价中药材质量好坏，只能在标准统计分析之后对分析结果进行验证。以品质为主要目标的育种工作中，既要考察有效化学成分的含量，也要把握种质的性状特征。本研究通过测定黄芩中黄酮类成分的含量，综合评价了不同黄芩种质的药材质量，对指导黄芩优良品种选育具有借鉴和参考作用。

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DeterminationandAnalysisofFlavonoidsIngredientsofDifferentScutellariaeRadixGermplasms

GAO Xiaoxia1，2，XURong2，CHENJun2，YUJing2，YANGChengmin2，LIUSai2ZHANGYongqin1，PENGYanli1*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.InstituteofMedicinalPlants，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100193，China)

Objective：To provide a basis for selecting high content of flavonoids ingredients of Scutellariae Radix germplasms by determination and analysis on three flavonoids ingredients and the total flavonoids of different Scutellariae Radix germplasms.Methods：The content of baicalin，baicalein and wogonin were determined by HPLC.And the total content of flavonoids of different ScutellariaeRadixgermplasm was determined byultraviolet-visible spectrophotometry.Principal component analysis and grey pattern recognition method was applied to comprehensive evaluation of different Scutellariae Radix germplasms quality.Results：Variance analysis results showed that the content of baicalin，wogonin and the total flavonoids were extremely significantly different among different germplasms.The baicalin and total flavonoids in germplasm 13 was higher than other germplasms.Germplasm 1 and 7，of which baicalin，baicalein and total flavonoids were all high.The analysis results of grey pattern recognition method verified that the Scutellariae Radix of germplasm 1，7 and 13 are optimal germplasms，which can be as selection objects ofScutellariabaicalensisnew varieties.Conclusion：The improved HPLC method is fit for determination for flavonoids ingredients of scutellariae Radix.There are significant difference between different Scutellariae Radix germplasms.Principal component analysis and the grey pattern recognition method is suitable for quality evaluation of different Scutellariae Radix germplasms.

Scutellariae Radix；flavonoids ingredients；principal component analysis；grey pattern recognition method

2015-12-17)

中医药行业科研专项(201107011)；工信部中药材扶持资金(2011-340)

*

彭艳丽，教授，研究方向：生药及中药的质量控制与品质评价；E-mail：pyl567@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.020