张家瑛，潘超美*，苏家贤，肖辛垣

(1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2.广东本草源科技有限公司，广东 梅州 514200)

贡菊不定芽离体诱导增殖培养条件的优化△

张家瑛1，潘超美1*，苏家贤1，肖辛垣2

(1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2.广东本草源科技有限公司，广东 梅州 514200)

目的：优化贡菊不定芽诱导与增值的培养条件，为建立和完善贡菊离体快繁体系奠定基础。方法：以贡菊无菌组培苗带芽茎段为试材，通过单因素、组合、正交试验等方法探讨不同植物生长调节剂对不定芽诱导、增值的影响，并对基本培养基进行优化。结果：优选出适用于不定芽诱导的细胞分裂素为6-BA，本实验条件下不定芽诱导最佳配方为：MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1或6-BA2.0-1mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；不定芽增值最佳配方为：MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；基本培养基优化结果为：大量元素MS标准浓度+铁盐1.5倍MS标准浓度+蔗糖20 g·L-1+椰子汁30 mL·L-1。结论：6-BA对不定芽诱导有显著影响，IBA、NAA对不定芽诱导增殖具有一定调节作用；基本培养基的改良优化可增强不定芽生长发育。

贡菊；不定芽诱导与增殖；条件优化

菊花来源于菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，是我国传统常用中药材(Chrysanthemi Flos)，其味甘、苦，性凉，具有清热解毒、止血消肿、疏肝明目等功效[1]。贡菊是我国药菊来源之一，可药食同源，具有广阔市场前景。

贡菊常栽培于海拔300～600 m、阳光与空气湿度适宜、气温偏低的地区[2]。广东本草源科技有限公司贡菊种植基地位于广东省梅州市大埔县东北部的西河镇，属亚热带季风性气候。昼夜温差大，气候温和，光照充足，雨量充沛，年平均气温21.19 ℃，年降水量维持在1500 mm左右，年日照时数1661 h[3-6]，是药菊生长的适宜地区。公司于2010年引种药菊，并种植成功，获得了较好的经济效益。经广州中医药大学潘超美教授和安徽中医药大学药菊专家王德群教授鉴定确认，该品种为“黄山贡菊”的生态适应型。

由于贡菊有性生殖败育，不能结实，故没有种子。生产上一直采用分株、扦插、埋根等无性繁殖方法生产种苗，但贡菊有严重的连作障碍，加上长期以来种植产区植株感染病害非常严重，造成种质严重退化和变异。本研究团队受广东本草源科技有限公司的委托，通过分离茎尖分生组织细胞和热处理脱毒离体培养技术，展开贡菊的脱毒快繁和提纯复壮繁殖种苗技术的研究。经过两年多的反复试验，已初步获得离体再生无菌丛芽和幼苗，并为种植基地提供了2万多株脱毒贡菊种苗。本研究是在本课题前期李露华等[7]工作的基础上，对贡菊不定芽诱导增殖条件进行了筛选优化，旨在完善贡菊离体快繁体系，为贡菊优质种苗的规范化、产业化生产及种质资源的可持续利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以本实验室前期诱导处理的脱毒无菌试管苗的带芽茎段为实验材料。

1.2 实验条件

所有实验所用培养基及实验操作工具均经过高压灭菌锅灭菌(温度121 ℃，灭菌时间16 min)，取出冷却后使用；实验材料均在一致环境条件下(除特别说明外，培养基pH 5.8～6.0，蔗糖20 g，琼脂6 g，温度(25±2) ℃、光照时间12 h·d-1，光照强度1600～2000 Lux)进行培养。

1.3 方法

1.3.1 不同细胞分裂素及质量浓度对不定芽诱导的影响 以MS为基本培养基及空白对照，选择细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-BA(0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1)、激动素KT(0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1)、苯基噻二唑基脲TDZ(0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1)进行单因素实验，重复3次，45 d后进行统计。

1.3.2 不同植物生长调节剂组合对不定芽诱导的影响 以MS为基本培养基，在筛选出合适的细胞分裂素后，设计不同配比的细胞分裂素与生长素组合(表3)，考察不同植物激素组合对不定芽诱导的影响。

1.3.3 不同植物生长调节剂组合对不定芽增殖的影响 以MS为基本培养基，按(表1)采用L16(45)设计三因素四水平的正交试验，考察不同配比6-BA、IBA、NAA三种植物生长调节剂对不定芽增殖的影响。

1.3.4 基本培养基的优化 无机营养成分优化：分别对基本培养基的大量元素浓度(MS标准大量元素浓度的1/4、l/2、1、3/2)、铁盐浓度(MS标准铁浓度的l/2、1、3/2、2)进行单因素试验，重复3次，45 d后进行统计。

有机营养成分优化：分别对蔗糖浓度(10、20、30、40 g·L-1)、椰子汁(0、20、30、40 mL·L-1)进行单因素试验，重复3次，45 d后进行统计。天然添加物种类是经前期对苹果汁、香蕉汁、马铃薯汁、椰子汁进行预实验筛选后，确定以椰子汁作为诱导贡菊不定芽增殖的天然添加物。

1.4 数据处理

用Excel表格进行数据整理及图表绘制，采用SPSS17.0及正交设计助手对数据进行分析，采用LSD法进行方差分析。

表1 L16(45)不定芽增殖试验因素水平表 /mg·L-1

2 结果与分析

2.1 不同细胞分裂素及质量浓度对不定芽诱导的影响

在贡菊不定芽诱导过程中，细胞分裂素种类及浓度的选择尤为关键。以不添加激素的MS处理组的诱导率对照，从表1可知，TDZ诱导率较低，且诱导不定芽易变异、出现玻璃化、芽体粘连现象，长势较差，当质量浓度n≥0.5 mg·L-1时抑制外植体分化并导致植株逐渐死亡；KT组处理在0.1～1.0 mg·L-1范围内随激素浓度的增高诱导率呈下降趋势，而变异率随着浓度增高呈升高趋势，在0.1 mg·L-1时诱导率及芽长势均优于高浓度处理组；6-BA在0.5～2.0 mg·L-1范围内随激素浓度的增高诱导率呈上升趋势，以6-BA 2.0 mg·L-1处理诱导效果最佳。综合上述结果可知，在贡菊不定芽诱导培养过程中，不宜添加TDZ，以6-BA(x>1.0 mg·L-1)或KT(x≤0.1 mg·L-1)诱导效果较好。

表2 不同细胞分裂素及质量浓度对不定芽诱导的影响

注：+表示芽长势弱，++表示长势一般，+++表示长势较好，++++表示长势良好；-表示诱导失败，无长势。

2.2 不同植物生长调节剂组合对不定芽诱导的影响

以2.1试验获得的初步培养条件为基础，添加不同配比的细胞分裂素及生长素(表3)。接种6～9 d左右基部开始出现少量愈伤组织，随后茎段腋芽开始萌动，15 d左右腋芽长出新芽，诱导出的不定芽有单芽也有丛芽。由表可知，在同种生长素种类和浓度的情况下，不同类型细胞分裂素对不定芽的诱导率及增值系数存在显著性差异，6-BA作用明显优于KT处理。同种细胞分裂素不同质量浓度(B1-B3、B6-B7)条件下，B2、B3诱导率无显著性差异，但增殖系数芽高存在显著性差异，B2较优；B6、B7诱导率与增值率均存在显著性差异，以B7组为佳。参考A4(诱导率80%)，可知加入生长素可降低变异率，对不定芽诱导具有一定调节作用。综合各项指标评价，B2、B7诱导效果最佳，贡菊不定芽诱导条件为：6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1或6-BA2.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1。

表3 不同植物生长调节剂组合对不定芽诱导的影响

注：同列数字后小写字母表示在P=0.05水平上的显著性差异。

2.3 不同植物生长调节剂组合对不定芽增殖的影响

表4-1 不定芽诱导增殖正交试验结果及直观分析表

表4-2 不定芽诱导增殖正交试验方差分析表

2.4 基本培养基的优化

2.4.1 无机营养成分的优化 大量元素提供植物生长所需矿质营养，满足植物生理需求。由表5可看出，增殖系数随着大量元素浓度升高呈先升后降趋势，D1长势较差，不定芽叶片发黄，植株矮小；D3长势最优，增殖系数达到6.28，芽体健壮；而浓度上升到D4时抑制不定芽生长，叶色变黄，增殖系数下降，与D3差异具有显著性。

植物主要以鳌合盐的形式吸收铁，因此实验采用EDTA-Fe作铁源，保证铁元素的有效性。E1处理诱导的不定芽叶片色黄，增殖系数居组内最低；E2E3组长势最佳，增殖系数及芽高均无显著性差异，但E3组叶色较绿，芽体健壮，品质较E2稍高；随着浓度继续升高，增殖系数下降，叶片由绿变为黄绿(E4)。综合上述实验结果，适合贡菊不定芽诱导增殖的无机营养条件为标准MS大量元素浓度及1.5倍MS铁盐浓度。

2.4.2 有机营养成分的优化 由表6可知，低浓度蔗糖组F1不定芽叶片卷曲，芽体较细，增殖系数较低；而高浓度蔗糖F4培养时不定芽叶片向背外卷，叶色变黄，增殖系数降低，长势差；合适的蔗糖浓度(20～30 g·L-1)增殖效果最好，两者不定芽增殖系数及芽高均无显著性差异，芽体健壮，生长状况较好，优选F2可节省培养成本。

离体培养时添加适当的天然添加物可增强植物分化、生长发育。由表6可知，以空白G1为对照，椰子汁对增殖系数及芽高影响有显著性差异，椰子汁可降低不定芽变异率，芽苗生长旺盛、粗壮，叶片浓绿、健康。尤以G3组增长系数及芽高指数最优，长势最佳。综合上述实验结果，适合贡菊不定芽诱导增殖的有机营养条件为蔗糖浓度20 g·L-1及椰子汁30 mL·L-1。

表5 无机营养成分对不定芽增殖的影响

注：同列数字后小写字母表示在P=0.05水平上的显著性差异；+表示芽长势弱，++表示长势一般，+++表示长势较好，++++表示长势良好。

表6 有机营养成分对不定芽增殖的影响

注：同列数字后小写字母表示在P=0.05水平上的显著性差异；+表示芽长势弱，++表示长势一般，+++表示长势较好，++++表示长势良好。

注：A.激素优化后示意图；B.天然添加物优化后示意图；C.优化前不定芽黄化现象；D.优化前不定芽玻璃化现象。图1 贡菊离体不定芽诱导增殖

3 讨论

内源和外源植物生长物质的种类和水平对植物的生长发育起关键作用[8]。在植物组织培养过程中，本试验首先对细胞分裂素进行初步筛选，通过对比6-BA、KT和TDZ三种常用的细胞分裂素对贡菊不定芽诱导的影响，发现6-BA与KT在一定浓度范围内对不定芽诱导均有作用。在本研究进一步对不定芽诱导条件进行优化时发现KT诱导作用不及6-BA效果佳；过高浓度的6-BA会导致不定芽变异率升高，芽体矮化；添加生长素可提高不定芽诱导率，以6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1或6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1诱导效果最好，诱导条件激素种类和浓度范围与陈黎等研究结果一致[9]。细胞分裂素和生长素的比例影响增殖系数和芽苗质量，采用正交试验对不定芽增殖影响因子进行筛选，可充分考虑各因子的相互作用，使研究结果具有实用性和可操作性[10]。结果表明贡菊对6-BA较敏感，单独使用6-BA时芽体较细弱，生长缓慢，增殖系数低，而加入NAA和IBA后增殖系数明显增高，且芽体健康健壮，最佳的增值条件为：6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1，而在同属植物菊花不定芽诱导研究中也表明适当比例的细胞分裂素和生长素组合使用对不定芽诱导效果比单一使用细胞分裂素效果更好[11]，这与本实验研究结果一致。

在贡菊不定芽诱导增殖过程中，针对芽苗出现玻璃化、黄化等现象，本试验对基本培养基无机和有机成分含量进行优化，以便进一步提高不定芽的质量。实验结果表明低浓度大量元素由于营养供给不足而导致不定芽叶片发黄，芽体细弱，而高浓度大量元素则抑制不定芽的增殖，以标准MS大量元素浓度最佳。裘文达[12]试验发现，低盐浓度的培养基对菊花芽诱导率极差；陈黎[9]、李云玲[13]等在对贡菊的组织培养中均采用 MS 培养基作为基本培养基，与本实验结果一致。铁与植物叶绿素的合成关系密切[14]，本研究结果表明低浓度铁盐导致不定芽叶片偏黄，而随着浓度升高，叶片颜色由黄转绿。缺铁可能会直接导致叶片黄化，以1.5倍MS标准铁盐浓度增殖效果最佳，长势旺盛。蔗糖是组培最常用的碳源之一，过高浓度蔗糖使培养基渗透压升高，从而抑制不定芽增殖；20～30 g·L-1蔗糖适用于不定芽诱导增殖，优选20 g·L-1可节省培养成本。早有研究发现添加天然添加物可促进植物生长，提高丛芽分化率[15]，本研究结果也表明添加30 mL·L-1椰子汁可有效提高不定芽增值率，促进芽体粗壮，提高不定芽质量。

与诱导愈伤再分化丛芽相比，直接诱导不定芽省去了脱分化的步骤，同时诱导所得芽体健壮，变异程度较低。本研究对贡菊不定芽离体诱导及增殖培养条件进行了优化，为控制贡菊的种苗质量标准、离体快繁技术和工厂化生产奠定了基础，对贡菊种质资源的可持续利用具有一定的参考价值。

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OptimizationofCultureConditionsinvitroofAdventitiousBudsInductionandProliferationofDendranthemamorifoliumTzvel.cv.Gongju

ZHANG Jiaying1，PANChaomei1*，SUJiaxian1，XIAOXinheng2

(1.GuangzhouUniversityofChineseTraditionalMedicine，GuangzhouPanyu510006，China；2.GuangdongHerbsourceTechnologyCompany，Meizhou514200，China)

Objective：The culture conditions of adventitious buds induction and proliferation were optimized to lay a foundation for establishing and perfecting the rapid propagation system ofDendranthemamorifolium.Methods：Single factor test，combination test and orthogonal test were used，also the compositions of basic medium were optimized to investigate the effect of different plant growth regulator on adventitious buds induction and proliferation.Results：The results showed that the optimum cytokinin for induction was 6-BA；the best medium for induction was MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1or 6-BA2.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；the best medium for propagation was MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；the optimized basic medium compositions were：basic MS macronutrients concentration+1.5 times Fe+sucrose 20 g·L-1+coconut water 30 ml·L-1.Conclusion：6-BA has obvious effect，and also IBA and NAA had regulating effect on induction and propagation of adventitious beds，in addition，the improved medium could promote adventitious buds growth.

Dendranthemamorifolium；Adventitious buds induction and proliferation； optimization

2015-11-06)

2014公益性行业科研专项(201407002)

*

潘超美，教授，研究方向：药用植物种质资源评价与可持续利用；Tel：(020)39358249，Email：tcmbotany@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.017