刘征辉，徐石勇，赵琳琳，魏静娜，郭永泽，白钢

(1.天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381；2.南开大学 药学院，天津 300071；3.天津海世达检测技术有限公司，天津 300381；4.天津市现代中药质量检验中心，天津 300381)

金银花中抗炎活性成分獐牙菜苷和獐牙菜苦苷定量方法的研究△

刘征辉1，2，徐石勇3,4，赵琳琳3,4，魏静娜3,4，郭永泽1*，白钢2

(1.天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381；2.南开大学 药学院，天津 300071；3.天津海世达检测技术有限公司，天津 300381；4.天津市现代中药质量检验中心，天津 300381)

目的：研究建立金银花中抗炎活性成分獐芽菜苷、獐牙菜苦苷同时定量的方法。方法：通过超高效液相色谱法对獐芽菜苷、獐牙菜苦苷进行含量测定。结果：结果表明獐芽菜苷进样量在6.85～548.00 ng、獐牙菜苦苷进样量在64.50～1 032.00 ng与峰面积呈良好线性关系，标准曲线分别为Y=495 534 7X-213 11(r=0.999 4)；Y=1 596 561X-24 132(r=0.999 9)。结论：所建立的定量方法快速简单，方法可靠，可作为金银花中抗炎活性成分的质量控制方法。

金银花；抗炎活性成分；超高效液相色谱法；獐芽菜苷；獐牙菜苦苷

金银花为忍冬科忍冬属多年生半常绿木本植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、凉散风热的功效，自古以来被誉为清热解毒的良药。“金银花”一名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。“金银花”一名为后世延用至今。在中国的历代医学文献中，均发现有金银花及其药效的记载。

《中华人民共和国药典》2010版收载的金银花功能为：清热解毒，疏散风热。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热血毒痢，风热感冒，温病发热。忍冬藤功能为：清热解毒，疏风通络。用于温病发热，热毒血痢，痈肿疮疡，风湿热痹，关节红肿热痛[1]。

实验室前期利用293t细胞及NF-κB双荧光素酶报告系统做抗炎活性实验，结果表明金银花的抗炎活性差异较大，选选择活性最好的指标做活性抗炎单体的筛选。通过UPLC-Qtof结合NF-κB双荧光素酶报告系统，将金银花中各个峰接出(每30秒接一个)，做活性筛选实验。结果筛出4个活性单体，并对这4个峰进行解谱鉴定，确定分别为绿原酸、木犀草苷、獐芽菜苷和獐牙菜苦苷，将这4个抗炎指标成分作为金银花多指标质量评价的物质基础。而绿原酸和木犀草苷已有药典方法进行检测，目前只需要开发獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的定量检测方法即可，本论文也着重从獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的定量方法作为抗炎活性研究的主要内容。

1 金银花研究进展

1.1 金银花的产地及品种

金银花原产于我国大陆，大部分省份均有分布，主要产地有山东、河北、河南等。金银花具有耐寒、耐盐碱、耐干旱等特点，是多年生深根药用植物，对自然环境适应性很强。在旱沙碱土地上移栽成活率高，萌发力强、生长迅速。

市场上金银花种植的品种比较多，主要有巨花一号、大毛花、树形四季花、九丰一号、豫封一号、金花三号等等。金银花的采摘和加工比较繁琐，是金银花的生产力不高的主要原因。

近年来，金银花开发利用有了突破性进展，在香料、化妆品、保健食品、保健饮料等领域逐渐被应用。除此之外，在南方沿海各大城市居民及日本、韩国、台湾、东南亚等国家和地区都有用金银花做药膳的饮食习惯。

1.2 金银花的炮制加工方法

在河北巨鹿、河南封丘、山东平邑3个金银花主产区的加工方法有晒干、阴干、土烤、烘干、杀青烘干等，不同的加工炮制方法对金银花质量影响较大。传统的炮制方法是土烤房，但效率不高、质量难以控制；现代方法使用在较低温度下的烘干机，循环空气达到强除湿的目的，能保证金银花颜色鲜艳，花型稳定，其有效成分损失少，实验结果表明经现代加工方法如烘干或者杀青的金银花多呈鲜绿色，有机酸损失较少。

1.3 金银花化学成分研究

现代文献记载，金银花主要含有机酸类、三萜类、黄酮类、环烯醚萜类、醇类及多种微量元素等[2-5]。其中除了绿原酸和木犀草苷作为金银花主要的抗炎指标成分外，环烯醚萜类中獐牙菜苷和獐牙菜苦苷也具有良好的抗炎效果[6-9]。以下研究内容将对金银花中环烯醚萜类成分獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的定量方法进行方法学验证。

图1 环烯醚萜类化合物结构图

2 实验材料

2.1 仪器设备

Waters ACQUITY UPLC H-Class Core system超高效液相色谱仪，Empower3色谱工作站，配置自动进样器、二极管阵列检测器、四元梯度泵。

2.2 主要试剂

标准品绿原酸(批号：110753-200413)，木樨草苷(批号：111720-200905)，均购自中国食品药品检定研究院。对照品獐牙菜苷(20mg，Z-009-131225，HPLC≥98%)、獐牙菜苦苷(20mg，Z-002-130427，HPLC≥98%)均购自成都瑞芬思有限公司。液相用水为Millipore超纯水；乙腈(Fisher，色谱纯)；磷酸、乙醇为分析纯。

2.3 样本来源

通过对金银花和山银花产区及药材市场进行调研，获得具有一定代表性的样本101份，各样本的獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的含量信息见列表。列表如下：

表1 样本信息列表

表1(续)

表1(续)

3 獐牙菜苷、獐牙菜苦苷定量方法的研究

3.1 对照品溶液的制备

精密称取对照品獐牙菜苷和獐牙菜苦苷适量，用25%甲醇水溶液配制成单个对照品储备液，獐牙菜苷浓度为0.274 mg·mL-1，獐牙菜苦苷0.258 mg·mL-1。

3.2 供试品溶液的制备

精密称取过80目筛的金银花粉末约0.1 g于50 mL锥形瓶中，精密加入25%甲醇水溶液10 mL，称定重量，超声30 min(250W，35 kHz，40℃)，放冷，补足减失的重量。摇匀，过0.45 μm滤膜，即得。

3.3 色谱条件

Waters H-Class超高效液相色谱仪，Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1×100 mm)；流动相：乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)，如表2.5进行梯度洗脱，柱温25 ℃；检测波长240 nm；进样量5 μL。对照品、供试品见图2和3。

表2 流动相梯度洗脱列表

图2 獐牙菜苷和獐牙菜苦苷对照品UPLC图谱

图3 金银花样品UPLC图谱

3.4 线性关系的考察

分别吸取獐牙菜苷对照品储备液0.05，0.25，1.00，2.00，4.00 mL，用25%甲醇水溶液定容至10 mL，配制成一系列不同浓度的溶液；同理，獐牙菜苦苷储备液吸取0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 mL，定容至10 mL。分别进样5 μL。以对照品标准溶液进样量μg为横坐标X，峰面积为纵坐标Y做曲线，得回归方程如表3。

表3 獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的标准曲线

3.5 稳定性考察

取50号样品1份，按照3.2的制备方法制备供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、15 h，测定样品中獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的峰面积，计算RSD分别为1.24%、0.97%。说明15 h内稳定性可以达到要求。

3.6 加样回收率试验

取50号样品6份，精密称取约0.05 g，分别加入其中含獐牙菜苷(0.274 mg·mL-1)0.2 mL和獐牙菜苦苷(0.258 mg·mL-1)的溶液2.0 mL，称定重量，再按照3.2的方法制得回收率用样品溶液，进样测定峰面积并计算，结果平均回收率分别为97.61%、102.36%，RSD依次为1.94%、2.37%。

3.7 样品测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10 μL，按3.3项下色谱条件测定，记录獐牙菜苷和獐牙菜苦苷峰面积，并用外标法计算其含量，RSD<3%。

4 讨论

提取溶剂的优选考察：以50号样品为例，考察不同溶剂的提取效率。结果表明：当提取溶剂为25%甲醇水溶液时提取效率最高，獐牙菜苦苷和獐牙菜苷基本被提取完全，故将25%甲醇水溶液作为最终的提取溶剂。

检测结果显示，獐芽菜苦苷含量最高的为金银花品种大毛花，来源于河北省巨鹿县，炮制方法为阴干，颜色为黄褐色，含量达到6.995%。另外，该5个种间獐芽菜苦苷含量均差异不显著，基本顺序为金银花>灰毡毛忍冬>华南忍冬>红腺忍冬>黄褐毛忍冬。

通过统计数据可以看到，獐芽菜苷含量最高的为金银花大毛花样本，来源于河北省巨鹿县市场，炮制方法为晒干，颜色为白色，獐芽菜苷含量达到0.585%。另外，该5个品种獐芽菜苷含量差异显著，基本顺序为金银花>红腺忍冬>华南忍冬>黄褐毛忍冬>灰毡毛忍冬。

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QuantitativeDeterminationofSwerosideandSwertiamarininLoniceraeFlos

LIU Zhenghui1，2，XUShiyong3，4，ZHAOLinlin3，4，WEIJingna3，4，GUOYongze1*，BAIGang2

(1.TianjinAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnologyResearchInstitute，Tianjin300081，China；2.CollegeofPharmacy，NankaiUniversity，Tianjin300071，China；3.TianjinHigh-standardQualityTestingLab.，Tianjin300081，China；4.TianjinCenterforQualityTestingofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300081，China)

Objective：To establish a quantitative determination method for sweroside and swertiamarin in Lonicerae Flos.Methods：UPLC was applied for the study.Results：The injection amount of sweroside(6.85-548.00 ng)and swertiamarin(64.50-1032.00 ng)had a good linear relationship with the peak area and standard curve regression equations were calculated as is forY=495 534 7X-213 11(r=0.999 4)andY=1 596 561X-241 32(r=0.999 9)，respectively.Conclusion：The established quantitative method is rapid，simple and reliable，can be used for the determination of sweroside and swertiamarin in Lonicerae Flos.

Lonicerae Flos；UPLC；sweroside；swertiamarin

2015-05-29)

十二五国家科技支撑计划项目(2011BAI07B07)

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郭永泽，研究员，研究方向：农产品、食品及中药检测；Tel：(022)27950185，E-mail：guoyz1971@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.015