詹泽苹，李华，黄亮，李文庆，辛立波，李文佳，钱正明，刘国柱*，邓炳初

(1.广东东阳光药业有限公司，广东 东莞 523808；2.广东省食品药品检验所，广东 广州 510180)

冬虫夏草繁育品与野生品红外指纹图谱一致性评价△

詹泽苹1，李华2，黄亮1，李文庆1，辛立波1，李文佳1，钱正明1，刘国柱1*，邓炳初1

(1.广东东阳光药业有限公司，广东 东莞 523808；2.广东省食品药品检验所，广东 广州 510180)

目的：建立冬虫夏草的红外指纹图谱检测方法，对冬虫夏草野生品、繁育品以及伪虫草(蝉花、虫草花、中华被毛孢菌丝粉、蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉)进行红外测试。方法：根据红外平均图谱、一阶导数图谱、二阶导数图谱和标准偏差图谱，判断这3种虫草的一致性。结果：在3000～2800 cm-1、1800～1000 cm-1、1000～800 cm-1，30批冬虫夏草繁育品和21批野生品的红外光谱图谱的指纹图谱具有较好的一致性，相似度均大于0.90；与伪虫草不一致，相似度均小于0.90。结论：该方法具有良好的专属性、重复性、稳定性和精密度，可用于冬虫夏草红外指纹图谱分析。

冬虫夏草；红外指纹图谱；一致性分析

冬虫夏草系麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis(BerK.)Sacc.寄生于鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫幼虫上所形成的子座及幼虫尸体的干燥复合体，具有补肾益肺、止血化痰的功能。红外光谱作为中药鉴别的辅助手段近年来发展较快，有成本低、操作便捷等特点[1]。目前红外指纹图谱已成为鉴定和分析不同产地及品种的药材内在质量的重要手段[2-3]。宋文军[4]利用红外进行了冬虫夏草野生品的分析与鉴别。王钢力等[5]采用近红外漫反射法对不同产地冬虫夏草进行鉴别。另外还有显微鉴别、紫外吸收光谱鉴别、高效毛细管电泳鉴别、分子鉴别等鉴别方法[6-10]。冬虫夏草繁育品为自然状态下育种，模拟高原环境培植而成，为证明冬虫夏草繁育品与野生品的化学成分一致性，本实验开发了冬虫夏草的红外光谱指纹图谱检测方法，并用该方法对21 批冬虫夏草野生品和30批繁育品进行检测以及相似度评价。

1 仪器与实验材料

1.1 仪器

红外光谱仪(布鲁克公司，TENSOR 27)；压片机(美国PIKE公司，Crush IR)；分析天平(METTER公司，XP204)。

1.2 试剂

溴化钾购于aladdin公司。

1.3 供试品

冬虫夏草野生品样本21批(编号：CSN-1～CSN-21)，包括青海冬虫夏草样本7批(编号：CSN-1～CSN-7)；西藏冬虫夏草样本7批(编号：CSN-8～CSN-14)，四川冬虫夏草样本7批(编号：CSN-15～CSN-21)；冬虫夏草繁育品30批(编号：CSC-1～CSC-30)，由东阳光药业研究院提供。以上样本经中国中医科学院研究员鉴定为冬虫夏草。

中华被毛孢菌丝粉(编号：a)为宜昌山城水都冬虫夏草有限公司生产；虫草花(编号：b)购自广东；蝉花(编号：c)购自江西；蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉(编号：d)购自江西。

2 方法

2.1 样品处理方法

取样品粉末(过三号筛)4 mg与溴化钾粉末200 mg混合，置于红外灯下，在玛璃乳钵中研磨均匀，装入压片模具100 mg，压制约1 min，制成透明薄片，置于红外光谱仪中进行测试。

2.2 检测条件

傅里叶变换红外光谱仪光谱范围4000～400 cm-1；分辨率4 cm-1；扫描次数16次；重复测定次数5次；溴化钾中红外分束器。

2.3 色谱图处理方法及评价

使用赛默飞世尔公司提供的OMNIC红外软件对原谱进行处理，得到红外平均图谱、一阶导数图谱、二阶导数图谱和标准偏差图谱。设原图平均图谱为对照图谱，计算各样品图谱与对照图谱的相似度。

3 结果与讨论

3.1 实验条件考察

3.1.1 装样量考察 取冬虫夏草样品粉末2 mg与溴化钾200 mg于玛瑙乳钵中研磨均匀，分别装入压片模具70、80、90、100、110、120 mg压片，压片质量结果见表1。装样量在100～110 mg时，压片效果较好，透明度好的压片能降低测量误差。

表1 不同装样量的压片质量

3.1.2 样品与溴化钾混合比例考察 分别称取样品2、3、4、5、6 mg与200 mg溴化钾研磨均匀后压片，将制得的供试片置于红外光谱仪中进行测试，结果表明，样品用量为4 mg时，压片效果较好，且红外吸收峰强度较好。

3.1.3 扫描次数考察 取3.1.2制得的供试片，置于红外光谱仪中，依次调整扫描次数为2、4、8、16、32、64进行测试，每个扫描次数条件下测试5次，结果表明，随着扫描次数的增加，谱图的重复性越好，但是测量时间增加。综合各种因素，选择药材的扫描次数为16。

3.1.4 重复测定次数考察 取3.1.2制得的供试片，置于红外光谱仪中，样品连续扫描3、4、5、6次得到红外图谱，经软件处理得到平均图谱、二阶导数图谱和标准偏差图谱。结果表明，测量次数越多，测得谱图的重复性越好，但样品测定时间越长，综合各种因素，选择冬虫夏草样品的重复测定次数为5次。

3.2 方法学考察

3.2.1 重复性考察 取同一批冬虫夏草样品粉末(过三号筛)，按2.1项下平行制备5份样品，分别置于红外光谱仪中按2.2项下检测方法进行测试。结果所得的原谱、一阶导数光谱、二阶导数光谱的谱线基本重合，表明本实验方法的重复性良好。

3.2.2 精密度考察 取冬虫夏草样品制得供试片，连续测定5次，取同一批冬虫夏草样品同法制片，连续测定3 d，对比红外指纹图谱。结果所得谱图的谱线基本重合，表明仪器日内和日间精密度均良好。

3.2.3 稳定性考察 取冬虫夏草样品制得供试片，放入干燥器内保存，分别在0、1、2、3、4、5、8、12、24 h测定所得红外谱图。结果显示24 h内所得红外图谱的谱线基本重合，表明样品压片后24 h内稳定。

3.2.4 专属性考察 主要考察类似产品对本方法有无干扰。取冬虫夏草样品及伪虫草(蝉花、虫草花、中华被毛孢菌丝粉、蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉)，分别进行红外测试，比较这5个样品红外谱图原图、一阶导数图谱及二阶导数图谱的差异。红外谱图原图显示冬虫夏草样品在3000～2800 cm-1及1800～1000 cm-1峰型与虫草花、中华被毛孢菌丝粉、蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉有较大的差异，而与蝉花谱图差异不明显；一阶导数光谱显示冬虫夏草样品在1000～800 cm-1峰型与蝉花谱图差异均较为显著；二阶导数光谱显示冬虫夏草样品与4种伪品的峰型均有不同程度的差别。

3.3 样品检测

按实验方法分别对青海、西藏、四川冬虫夏草野生品21批、繁育品30批以及伪虫草(中华被毛孢菌丝粉、虫草花、蝉花、蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉)进行红外测试，得到红外图谱原图，用Norris导数过滤器对红外图谱原图进行处理，得到一阶导数图谱和二阶导数图谱。将21批冬虫夏草野生品所得到红外谱图进行平均化后再进行平均，得到平均图谱，设置此谱图为标准图谱；用Norris导数过滤器对该平均图谱进行处理，得到一阶导数图谱和二阶导数图谱。采用OMNIC软件的“QC Compare”功能将冬虫夏草繁育品30批供试样品、21 批野生品和伪虫草的红外图谱原图与标准指纹图谱进行比对，得到相似度结果见表2。从红外图谱总体分布特征来看，冬虫夏草野生品和繁育品共51批基本一致。从相似度结果来看，30批冬虫夏草繁育品和21批野生品的相似度均大于0.90，而伪虫草(虫草花、蝉花、蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉和中华被毛孢菌丝粉)的相似度均小于0.90，与前期报道结果一致[1，3]。冬虫夏草野生品、CSC-10批冬虫夏草繁育品以及伪虫草(中华被毛孢菌丝粉、虫草花、蝉花、蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉)的红外原图谱、一阶导数图谱和二阶导数图谱的叠加对比图，见图1。以上结果显示30批冬虫夏草繁育品和21批野生品的红外光谱图谱的指纹图谱具有较好的一致性，与伪虫草不一致。

表2 冬虫夏草红外图谱原图相似度结果

注：CSC-1～30为冬虫夏草繁育品，CSN-1～21为冬虫夏草野生品，a～d为伪虫草。

注：A.红外图谱，B.一阶导数图谱，C.二阶导数图谱。图1 冬虫夏草野生品、繁育品和伪虫草的红外指纹图谱

4 结论

本实验建立的冬虫夏草红外指纹图谱检测方法具有良好的专属性、重复性、稳定性和精密度；冬虫夏草样品在3000～2800 cm-1、1800～1000 cm-1、1000～800 cm-1峰型与伪虫草谱图差异较为显著，可用于冬虫夏草红外指纹图谱检测。30批冬虫夏草繁育品和21批野生品的红外指纹图谱具有较好的一致性，鉴定结果与本研究组已报道的HPLC、NMR等[11-13]方法的鉴定结果一致。

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ConsistencyEvaluationofIRFingerprintsofCultivatedCordycepsandNaturalCordyceps

ZHAN Zeping1，LIHua2，HUANGLiang1，LIWenqing1，XINLibo1，LIWenjia1，QIANZhengming1，LIUGuozhu1*，DENGBingchu1

(1.SunshineLakePharmaCo.，LTD，Guangdong，Dongguan523808，China；2.GuangdongInstitutionforFoodandDrugControl，Guangzhou510180，China)

Objective：In this research，an IR fingerprint analysis method was developed for identifying Cordyceps.Methods：Natural Cordyceps，cultivated Cordyceps and pseudo Cordyceps(cicada fungus，Cordyceps flower，hirsutella mycelium powder and paecilomyces hepiali mycelium powder)were identified respectively by this method.The conformity of the samples were estimated according to the similarity of IR average spectra，first-order derivative spectra and second derivative spectra.Results：The IR fingerprint had good uniformity between 30 batches of cultivated Cordyceps and natural samples in the range of 3000-2800 cm-1，1800-1000 cm-1and 1000-800 cm-1，with similarity not less than 0.90.However，the pseudo Cordyceps obtained inconsistent results，with similarity less than 0.90.Conclusion：The method is proved specific，sensitive and accurate，which is suitable for identification of Cordyceps.

Cordyceps；IR fingerprint；conformity analysis

2015-09-25)

中医药行业科研专项(201507002)；创新药物研发与产业化团队(201001Y0104742262)

*

刘国柱，博士，研究方向：药物分析；Tel：(0769)88615888，E-mail：LiuGuozhu@hecpharm.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.012