陈丽艳，刘青，张蕾，方自若，王伟明

(黑龙江省中医药科学院 中药研究所，哈尔滨 150036)

分离筛选淡豆豉发酵菌的培养基优化△

陈丽艳，刘青，张蕾，方自若，王伟明*

(黑龙江省中医药科学院 中药研究所，哈尔滨 150036)

目的：优化适用于淡豆豉发酵菌种分离筛选的选择性培养基以达到科学、简便、快速获得淡豆豉优势发酵菌的目的。方法：采用含有桑叶、青蒿煎煮液的药性培养基与另外4种微生物常规培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，孟加拉红(RA)，察氏琼脂(CA)，营养琼脂(NA)于(28±2) ℃恒温培养淡豆豉发酵菌，比较菌群组成、比例的变化规律。结果：采用含青蒿、桑叶药性选择性培养基分离筛选淡豆豉发酵菌优于其他5种常规培养基，体现出科学、简便、快速、专一的特性。结论：根据不同发酵辅料，确立专属选择性培养基的方法同样可以应用于各种发酵类中药优势发酵菌的分离筛选。

淡豆豉；选择性培养基；发酵菌

淡豆豉(SojaeSemenPraeparatum)是以大豆(Glycinemax(L.)Merr)为主要原料，以青蒿、桑叶等为辅料经过发酵加工而成的中药饮片，具有解表，除烦，宣发郁热的功效，用于感冒，寒热头痛，烦躁胸闷，虚烦不眠[1]。淡豆豉始载于《名医别录》，历代本草均有收载，自有记载以来，淡豆豉一直按传统发酵工艺以青蒿、桑叶、大豆为原料借助自然环境中的微生物发酵制得[2]。由于生产地域、环境条件、原料来源、生产季节等因素的影响，参与发酵的微生物种群变化较大，不仅有发酵优势菌群，也混入一些与发酵无关甚至有害微生物，导致产品质量不稳定、不可控，可能存在安全隐患[3-5]。因此，对参与发酵中药的微生物种群进行考查，保留适应发酵的优势菌、剔除杂菌至关重要。本研究通过与普通培养基对比，优化适用于淡豆豉发酵菌种分离筛选的选择性培养基以达到科学、快速、简便获得淡豆豉优势发酵菌。

1 材料

1.1药材

淡豆豉中药饮片(购自哈尔滨北京同仁堂药店，批号：20150801)。桑叶(批号：140101)、青蒿(批号：140101)购自河北祁新中药颗粒饮片有限公司，以上淡豆豉饮片及药材经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为淡豆豉为大豆Glycinemax(L.) Merr.的成熟种子的发酵加工品，桑叶为桑MorusalbaL.的干燥叶，青蒿为黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分。

1.2仪器

迅数MF3型多功能一体机(杭州迅数科技有限公司)，DHP9272恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，DL-CJ-2N净化工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，BSA224S赛多利斯电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.3培养基

察氏琼脂培养基(CA，20150508)，营养琼脂培养基(NA，20150428)，马铃薯葡萄糖琼脂(PDA，20150916)，琼脂粉(20150606)，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；孟加拉红培养基(RA，20141220)购自青岛海博生物技术有限公司；Corning培养皿(φ=90mm，美国Coring公司)。

1.4药性选择性培养基的配制

1.4.1桑蒿琼脂培养基(SHA)：取青蒿70～100g，桑叶70～100g，加水煎煮2h，过滤，滤液浓缩至1000mL，加黄豆粉30g，葡萄糖20g，琼脂15g，121℃高压灭菌20min。

1.4.2黄豆粉琼脂培养基(桑蒿培养基空白对照)：黄豆粉30g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌20min。

1.4.3PDA、RA、CA、NA培养基按照说明书使用前配制，灭菌备用。

2 方法

2.1淡豆豉菌液的提取及制备

取淡豆豉饮片5g，在无菌条件下用0.9%的无菌生理盐水洗涤三次，除去中药淡豆豉饮片上附着的杂质，然后转移至已灭菌的研钵中加45mL无菌生理盐水研磨，制成稀释度为10-1的菌液母液，按照10倍稀释法依次用无菌生理盐水进行梯度稀释，得到稀释倍数为10-2～10-9的菌液，涂于不同培养基进行培养，根据每种培养基生长的菌落数量选择合适的稀释度。

2.2淡豆豉发酵菌培养基优化

2.2.1桑叶、青蒿不同加药量对淡豆豉发酵菌群生长影响 根据2015年版《中国药典》淡豆豉的制备工艺[1]中桑叶、青蒿的加入量，按照青蒿70～100g、桑叶70～100g的不同比例进行组合，共组合16组，每组编号及青蒿、桑叶比例见表1，每组加水煎煮2h获得煎煮液并浓缩至1000mL。以黄豆粉琼脂培养基(以蒸馏水代替桑叶、青蒿煎煮液)为对照(编号17)，按照1.4配制桑蒿琼脂培养基与黄豆粉琼脂培养基，灭菌前测定培养基的PH值。

每个编号平行3个培养皿，将100μL菌液接种到SHA培养基和黄豆粉琼脂培养基上，(28±2)℃恒温培养6d，每天观察并记录各组出现的菌群类型及生长情况。

表1 药性培养基的编号及青蒿、桑叶的比例(g：g)

2.2.2 不同培养基对淡豆豉发酵菌群种类的分离筛选：将100 μL菌液分别接种至PDA、NA、CA、RA培养基。每种培养基平行三个皿，(28±2) ℃恒温培养6 d，每天观察并记录出现菌群类型及生长情况。

2.3菌种的分离纯化

将以上5种培养基生长的菌落进行分离纯化，用无菌接种环挑取单个菌落在PDA培养基上分区划线培养，分离的单个菌落再移接至PDA斜面试管中培养、保存。

2.4分离菌株在不同培养基的生长情况考察

根据2.3培养分离菌的菌落形态及显微特性初步鉴别为1号毛霉、2号毛霉、酵母菌、杆菌、球菌及3号霉菌(疑似曲霉)，将以上6株菌分区接种至不同培养基的同一培养皿中，(28±2) ℃恒温培养48h，观察并记录菌的生长情况。

2.5以上实验重复两次。

3 结果

3.1桑叶青蒿加药量的确定

采用PH试纸测得1～17号培养基的PH值均在6～7之间，菌种生长情况如表2。1～16号各组菌群生长表型相近，数量波动较小，不同生长时期可见明显的菌群特征，培养第3d时皆霉菌布满平皿。17号黄豆粉培养基中细菌数目较多，虽然个别培养皿中有霉菌出现，但生长不旺盛。桑叶、青蒿的不同配比对淡豆豉优势菌群的生长影响无显著差异，根据桑叶、青蒿的作用不同及文献报道(详见4讨论部分)确定桑叶100g、青蒿70g的水煎液浓缩至1000mL，再加葡萄糖、黄豆粉、琼脂配制成SHA培养基。

表2 青蒿、桑叶不同加药量制得的SHA培养基菌群生长特征

3.2不同培养基对淡豆豉发酵菌种的分离筛选

通过实验筛选，最终确定稀释度为10-3的菌液在不同培养基上培养菌落分布及数量适宜，菌群类型及表型数目如图2和表3。

图2 淡豆豉菌液在不同培养基的生长情况直观图

培养基菌群类型表型数目SHA细菌、霉菌3NA细菌、霉菌4PDA细菌、霉菌、酵母5RA霉菌2CA霉菌、酵母3

图2和表3显示PDA培养基上表型数目最多，以优势的毛霉为主；NA培养基上细菌繁多，霉菌生长有颜色变化；RA培养基上霉菌生长较旺盛，根据菌落形态的不同可区分出不同霉菌菌株；CA培养基上细菌菌落较其他培养基生长的菌落大，可以根据形态表型加以识别，霉菌无色，表层或有星点状物；SHA培养基上明显可见三种菌群表型，面积最大的一种疑似高大毛霉，有两个霉菌菌落的表面布满灰色颗粒状，还有数量最多的一种细菌，可以观察到细菌由凸出奶白色油滴状逐渐失水干瘪皱缩颜色变黄，霉菌由初生时白色菌丝到后期颜色变灰或皱缩后表面呈现颗粒状。

3.3分离菌株在不同培养基的生长情况考察

6种菌株在不同培养基的生长情况如图3和表4。表4显示SHA培养基对1号和2号霉菌的生长均显示一定的促进作用，对3号霉菌有一定抑制作用，对4号、5号细菌的生长也显示出抑制作用，对酵母菌的生长无明显影响；NA培养基对2号霉菌和3号霉菌生长有抑制作用，细菌生长旺盛，故可以用于细菌的培养；PDA培养基上所有菌均生长较好，故而用其制作斜面试管用于菌种初期的分离与后期

1：1号毛霉；2：2号毛霉；3：酵母；4：杆菌；5：球菌；6：3号霉菌(疑曲霉)图3 分离菌株在不同培养基上的生长情况

保存；RA培养基上3号霉菌长势较SHA培养基好，但不如PDA培养基，PDA培养基上可见绿色老菌丝，RA培养基上酵母菌生长较好，杆菌、球菌生长被抑制，所以可用于霉菌的纯化；CA培养基所有的菌生长均不太旺盛，因其为化学合成培养基，成分较稳定，故可以用于霉菌显微形态学鉴定。结合图3，对比2号霉菌在各培养基上生长情况可知，SHA培养基不会造成发酵菌的缺失；对比球菌和3号霉菌在不同培养基上的生长情况可知，SHA培养基可有效抑制杂菌的生长。

表4 分离菌株在不同培养基的生长情况

4 讨论

区别于天培、纳豆等其他豆类发酵食品、保健品[6，7]，中药淡豆豉在发酵中加入青蒿、桑叶两味中药做辅料，明确具有解表，除烦，宣发郁热的药用功能。其中青蒿能够清虚热、除骨蒸、解暑热、截疟、退黄；桑叶能够疏散风热、清肺润燥、清肝明目。根据2015年版《中国药典》规定，青蒿、桑叶是淡豆豉发酵的重要外部环境，用青蒿、桑叶煎煮液制备培养基,用来培养淡豆豉发酵菌可以模拟淡豆豉发酵时的外部环境，对菌种进行筛选。通过实验对比，青蒿、桑叶的不同配比制成的SHA培养基对淡豆豉发酵菌的生长无显著影响，又由于桑叶具抑菌作用，可以用来抑制或干扰与本发酵无关的细菌滋生[8]，且能够影响淡豆豉的解表、宣发郁热功效，所以选择桑叶最大量100g；青蒿能够杀灭疟原虫等致病虫的配子体，用量相对少，选择青蒿最小量70g的组合[9]。适当的桑叶、青蒿用量可保证中药淡豆豉的功效，这也与河北医科大学牛丽颖教授研究以大豆苷元、染料木素、异黄酮目标产物的含量为标准,确定桑叶加样量最高，青蒿次之的结果一致[10]。

SHA培养基用2%的葡萄糖做碳源，用3%的黄豆粉做氮源[11]，加入青蒿、桑叶煎煮液模拟菌种生长环境，针对性强，可完全满足中药淡豆豉发酵中所有优势菌群的生长需要，不会造成菌群缺失；选择性好，优势菌群可以在发酵过程中壮大，有效抑制杂菌的生长，从而避免杂菌的干扰和影响。采用含青蒿、桑叶药性选择性培养基在分离筛选中药淡豆豉发酵菌中优于常规分离筛选培养基，体现出科学、简便、快速、专一的特性。根据不同药性基质，确立专属选择性培养基的方法同样可以尝试应用到其他发酵中药如六神曲等优势菌种的筛选。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015：328.

[2] 石素琴.淡豆豉炮制工艺及质量标准研究[D].河北医科大学，2010.

[3] 牛广财，贾亭亭，魏文毅，等.淡豆豉的研究进展[J].中国酿造，2013，32(9)：1-5.

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[11] 诸葛健，李华钟.微生物学(第二版)[M].北京：科学出版社，2015：172-175.

OptimizationofSelectiveMediumtoIsolateFermentationMicrobesfromSojaeSemenPraeparatum

CHENLiyan，LIUQing，ZHANGLei，FANGZiruo，WANGWeiming*

(HeilongjiangAcademyofTraditionalChineseMedicine，InstituteofChineseMateriaMedica，Harbin150036,China)

Objective：This study is aimed to optimize the selective medium to isolate Sojae Semen Praeparatum fermentation microbes sciencely，simplely and quickly.Methods：Four conventional medium：potato extract glucose agar medium (PDA)，Martin's medium (RA)，Czapek's agar medium (CA)，Nutrient agar (NA) were compared with the medicinal medium contained with extract liquid from Mori Folium and Artemisiae Annuae Herba，which are used to culture and isolate fermentation microbes from Sojae Semen Praeparatum at (28±2) ℃ to observe variation law of microbial flora and proportion.Results：The selective medium contained Mori Folium and Artemisiae Annuae Herba extract liquid was superior to the conventional medium to isolate Sojae Semen Praeparatum fermentatiom microbes.Medicinal medium showed the features of science，simplicity，rapidity and uniqueness.Conclusion：According to the different fermentation medicinal matrix，establishing the method of exclusive and selective medium can also be applied to other fermentation Chinese medicine.

Sojae Semen Praeparatum；selective medium；fermentation microbes

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.005

2016-01-25)

公益性行业科研专项经费项目(201507004-03)

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王伟明，研究员;研究方向：中药基础研究及应用开发；Tel：(0451)55665478，E-mail：1442540238@qq.com