陈明明，王开林，杨林昆，李林辉，王宝英，王福兄，郝志明

(天津农学院 动物科学系，天津 300384)



-80 ℃超低温冰箱冷冻保存猪精液的初步研究

陈明明，王开林，杨林昆，李林辉，王宝英，王福兄，郝志明

(天津农学院 动物科学系，天津 300384)

本试验从细管规格、基础稀释液成分(柠檬酸和甘氨酸)、甘油浓度和解冻方法对猪精液在-80 ℃超低温冰箱中冷冻保存冻后精子存活率的影响进行了研究。结果表明：(1)0.25 mL和0.5 mL细管之间没有明显差异(P>0.05)，其冻后存活率均达到0.57左右。(2)冷冻液中甘油浓度为3%时，冻后猪精子存活率最高，达0.50±0.035；基础液中柠檬酸的含量为1.3%时，精子的冻后存活率极显著高于1.7%时(P<0.01)；基础液中甘氨酸的含量为7.5 mg/mL时，则不能影响精子的冻后存活率(P>0.05)。(3)解冻方法为61 ℃ 5 s时，精子冻后存活率最高，达0.61±0.055。

猪精液；-80 ℃超低温冰箱；细管规格；柠檬酸；甘氨酸；甘油浓度；解冻方法

1776年，Spallanazani将青蛙、马和人类的精液置于雪中以尝试冷冻保存[1]。此后，精液0 ℃以下保存的研究受到了广泛的关注。直到1949年，Polge等[2]发现甘油对精子具有抗冻保护作用后，精液的冷冻保存技术才取得了重大的突破，并于1956年，首次成功冷冻保存了猪精液[3]。但此后多年，由于猪精子对低温更加敏感，以及猪输精量大和常温保存较为成功，使猪精液的冷冻保存研究和应用停滞不前。近些年来，随着低温生物学以及牛、犬等动物精子冷冻保存技术的发展，猪精子冷冻保存的研究明显增多，效果显著提高，冻后存活率超过0.5的研究报道比比皆是[4～7]。精液冷冻保存的方法有采用液氮作为冷源的，也有用干冰作为冷源的。本试验以-80 ℃超低温冰箱为冷源，对猪精液的冷冻保存进行了初步研究，以期探索其可行性及其效果。

1　材料与方法

1.1主要仪器与试剂

超低温冰箱(DW-86L386，青岛海尔股份有限公司)，恒温水槽(ZSBB-712，上海智城分析仪器制造有限公司)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)(Novon公司)，甘氨酸(Gly)、柠檬酸(CA)和甘油(均来自天津市北方天医化学试剂厂)。

1.2精液的来源

猪鲜精来自于天津市警备区种猪场。毛巾包裹运输，1 h内运回实验室并置于17 ℃恒温箱中待用。

1.3稀释液的制备

基础稀释液配方：Tris 3.04%，柠檬酸1.30%或1.70%，葡萄糖1.25%，青霉素0.06%，链霉素0.10%，双蒸水100 mL。添加甘氨酸组中，其添加量为7.5 mg/mL。

稀释I液：为含有20%新鲜卵黄的基础稀释液。

稀释II液：为含有4%、6%或8%甘油的稀释I液。

1.4稀释与平衡

取4 mL精液于离心管，2 000 r/min离心4 min，去上清液。加入2 mL等温的稀释I液并混匀，再次离心并去上清液。再加入4 mL等温的稀释I液，混匀后吸取4 mL于另一离心管内并封口，然后置于装有400 mL等温水的500 mL的烧杯中，与烧杯一起放入4 ℃的冰箱降温。待降温至4 ℃后，按1∶1的比例加入也已降温至4 ℃的稀释II液，混匀后继续在4 ℃冰箱放置2～4 h。

1.5精液的分装

将精液吸入已预冷至4 ℃的0.25 mL 或0.5 mL的细管中，使精液处在细管中部，细管内精液的长度约2～3 cm。

1.6冷冻与解冻

将分装好的细管迅速放入-80 ℃超低温冰箱中的塑料泡沫上，冷冻10 min。然后迅速放入37 ℃、45 ℃、53 ℃、61 ℃或69 ℃的水浴锅中进行解冻，解冻时间有5 s、8 s或11 s。

1.7存活率检查

解冻后首先在37 ℃恒温箱中放置5 min，然后取少量置于显微镜下，观察存活精子个数，算出精子存活率。观察时至少观察5个视野，每个视野观察10个精子。

1.8数据处理

采用SAS 9.2统计软件对试验数据进行单因素方差分析，并在F值显著情况下进行Duncan’s多重比较。

2　结果与分析

2.1细管规格对猪精子冻后存活率的影响

由表1可知，用0.25 mL和0.5 mL的细管冷冻保存的猪精子，其冻后存活率都较高，达0.57左右，但两种细管之间没有明显差异(P>0.05)。

表1细管规格对猪精子冻后存活率的影响

细管规格存活率0.25mL0.57±0.027a0.5mL0.57±0.045a

注：表中上标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，上标大写或小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下同。

2.2柠檬酸和甘氨酸对猪精子冻后存活率的影响

表2的结果表明，1.3%柠檬酸组冻后精子存活率极显著高于1.7%柠檬酸组(P<0.01)，其存活率均达0.50以上，而添加甘氨酸后，无论是对1.3%柠檬酸组还是对1.7%柠檬酸组，均没有明显影响(P>0.05)。

表2基础液配方对猪精子冻后存活率的影响

基础液配方存活率1.7%CA0.45±0.035Bb1.7%CA+Gly0.42±0.027Bb1.3%CA0.51±0.022Aa1.3%CA+Gly0.52±0.027Aa

2.3甘油浓度对猪精子冻后存活率的影响

甘油浓度为3%时，冻后精子存活率最高，达0.50±0.035，显著高于4%的甘油组(P<0.05)，极显著高于2%的甘油组(P<0.01)。详见表3。

表3甘油浓度对猪精子冻后存活率的影响

甘油浓度存活率2%0.20±0.035Bc3%0.50±0.035Aa4%0.44±0.042Ab

2.4解冻方法对猪精子冻后存活率的影响2.4.1解冻温度对猪精子冻后存活率的影响

从表4来看，解冻时间为5 s时，体温温度(37 ℃)解冻后的精子存活率最低，仅为0.39±0.022，极显著低于温度高于体温(包括45 ℃、53 ℃、61 ℃和69 ℃)时的冻后精子存活率(P<0.01)；在高于体温温度的解冻方法之间，45 ℃组和61 ℃组的冻后精子存活率极显著高于53 ℃组和69 ℃组的冻后存活率(P<0.01)，而45 ℃和61 ℃组之间以及53 ℃和69 ℃组之间则均没有明显的差异(P>0.05)。5种解冻温度中，61 ℃的冻后存活率最高，达0.61±0.055。

表4解冻温度对猪精子冻后存活率的影响

解冻温度存活率37℃0.39±0.022Cd45℃0.57±0.045ABab53℃0.51±0.022Bc61℃0.61±0.055Aa69℃0.53±0.045Bbc

2.4.2解冻时间对猪精子冻后存活率的影响

在解冻温度为61 ℃的条件下，本试验还对解冻时间进行了研究。表5的结果表明，解冻时间为5 s时，精子冻后存活率最高，其存活率达0.61±0.055，极显著高于解冻时间为11 s时的冻后存活率(P<0.01)，显著高于解冻时间为8 s时的冻后存活率(P<0.05)。解冻时间8 s和11 s之间比较，差异不显著(P>0.05)。另外，随着解冻时间的延长，冻后猪精子的存活率有逐渐下降的趋势。

表5解冻时间对猪精子冻后存活率的影响

解冻时间存活率5s0.61±0.055Aa8s0.54±0.042ABb11s0.49±0.042Bb

3　讨论

3.1精子超低温冰箱冷冻保存

在细管冷冻精液出现之前，人们曾用干冰冷冻精子，也取得过不错的效果。干冰的温度为-79 ℃，与-80 ℃超低温冰箱的温度非常接近。我们知道，许多动物的精子在干冰上进行过冷冻保存的研究和应用，如牛和犬。据此推测，-80 ℃的超低温冰箱也应该能够冷冻保存动物精子。2011年，闫秀明等[8]曾将黄鳝精液装入细管并在-80 ℃超低温冰箱中冷冻保存168 h后，发现其相对活力仍可达88%。但在家畜，还没有见到在-80 ℃超低温冰箱中冷冻保存精子的相关报道。从本试验来看，-80 ℃超低温冰箱也可冷冻保存猪精子，且可获得冻后存活率达0.61±0.055的效果。

3.2甘油浓度、柠檬酸和甘氨酸对猪精子冻后存活率的影响

Buhr等[9]研究发现，2%和4%的甘油能使猪精子的冻后活力和质膜完整性显著高于0%和8%的甘油。姜兴刚等[10]研究表明，添加2%和4%的甘油对猪精子的冷冻保护作用显著高于添加0%和8%甘油组，2%和4%两个浓度之间差异不显著。而本试验研究结果表明，在2%～4%的甘油浓度范围内，3%的甘油浓度冻后精子存活率最高，与Buhr等[11]和姜兴刚等[10]的研究结果相近。

精液中的柠檬酸可维持pH和渗透压的稳定。甘氨酸则不仅能够稳定细胞内外pH和渗透压，提高精子对冷应激的耐受性，而且还能减少脂蛋白的代谢，缓解脂蛋白在冷冻过程中的损伤[12]。故本试验对稀释液中柠檬酸和甘氨酸的作用也进行了研究。表3的研究结果表明，柠檬酸含量能够明显影响冻后猪精子的存活率，1.3%的柠檬酸添加量极显著优于1.7%的柠檬酸添加量。而甘氨酸的添加则并未能影响猪精子的冻后存活率，这或许是由于甘氨酸添加量不适所致。

3.3解冻方法对猪精子冻后存活率的影响

Medrano A等[13]的研究表明，解冻与冷冻相似，都会使精子质膜受到损伤。要避免精子质膜的损伤，就需要在解冻过程中快速越过-60 ℃和-15 ℃的两个临界温度区，就需要控制好解冻速率，控制好决定解冻速率的解冻温度和解冻时间。从理论上来说，细管的容量越大，降温的速度就会越慢。但就0.25 mL和0.5 mL细管来讲，不同的研究者所获得的研究结果差异也很大。梁鸿斌等[14]发现，对0.25 mL的猪细管冷冻精液，37 ℃ 30 s的解冻效果最好。但张渭斌等[15]研究后认为，对于0.5 mL的猪细管冷冻精液，50 ℃ 13 s的解冻要明显好于38 ℃ 30 s的解冻。杜立银等[16]的研究结果则表明，57 ℃ 10 s或62 ℃ 5 s的解冻，猪精液冷冻效果最佳。本试验结果与杜立新等的研究结果相似，61 ℃ 5 s的解冻冻后存活率最高，冻后存活率达0.61±0.055。从这些研究来看，似乎解冻速度越快，解冻后的精子存活率越高，但当温度达到69 ℃时，解冻后的精子存活率反而出现下降。

[1]Bwanga C O.Cryopreservation of boar semen[J].Acta Vet Scand，1991，32(4)：431-453.

[2]Polge C，Smith A U，Parkes A S.Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures [J].Nature，1949，666：666.

[3]郭堂玉，杨泽继，韦明宇，等.不同冷冻保护液和解冻温度对猪精液冷冻效果的影响[J].中国兽医学报，2010，30(7)：1000-1004.

[4]Huang SY，Pribenszky C，Kuo YH，et al.Hydrostatic pressure pretreatment affects the protein profile of boar sperm before and after freezing-thawing[J].Anim Reprod Sci，2009，112(1-2)：136-149.

[5]Woelders H，Matthijs A，Zuidberg CA，et al.Cryopreservation of boar semen: equilibrium freezing in the cryomicroscope and in straws[J].Theriogenonogy，2005，63(2):383-395.

[6]Córdova-Izquierdo Al，Oliva JH，Lleó B，et al.Effect of different thawing temperatures on the viability，in vitro fertilizing capacity and chromatin condensation of forzen boar semen packaged in 5mL straws[J].Anim Reprod Sci，2006，92(1-2):145-154.

[7]Lee Ys，Lee S，Lee SH，et al.Effect of cholesterol-loaded-cyclodextrin on sperm viability and acrosome reaction in boar semen cryopreservation[J].Anim Reprod Sci，2015，159:124-130.

[8]闫秀明，张林达，张小雪.黄鳝精液-80 ℃超低温冷冻保存试验[J].四川动物，2011，30(2)：207 - 211.

[9]Mary M,Buhr,Paul Fiser，et al.Cryopreservation in different concentrations of glycerol alters boar sperm and their membranes[J].Journal of Andrology，2001，22(6)：961-969.

[10]姜兴刚，赵桂英，和绍禹，等.冷冻前离心方法、平衡时间、甘油浓度对猪精子冷冻保存的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2008，6：42-43.

[11]罗光彬，王宝生，贾俊龙，等.甘氨酸及二甲基亚砜对冷冻保存兔精液活率的影响[J].沈阳农业大学学报，2011，42(6)：733-735.

[12]Medrano A，Watson PF，Holt WV.Importance of cooling rate and animal variability for boar sperm cryopreservation：insights from the cryomicroscope[J].Reproduction，2002，123(2)：315-322.

[13]梁鸿斌，姚学军，李维华，等.冷冻速率和解冻温度对猪精液冷冻效果的影响[J].中国畜牧兽医，2012，39(11)：157-160.

[14]张渭斌，刘丑生，孙世铎，等.咖啡因对猪精液冷冻的影响及冷冻-解冻方法的优化[J].中国畜牧兽医，2010，37(10)：148-151.

[15]杜立银，曹少先，刘铁铮.猪精液0.5 mL细管快速冷冻和解冻方法的优化[J].中国农业科学，2009，42(5)：1875-1880.

2016-05-05

陈明明(1992-)，男，硕士研究生。

郝志明(1963-)，男，陕西绥德人，教授，硕导。研究方向：动物繁殖和配子生物工程技术。

E-mail:haozhimingg@163.com

S828.3

A

1005-2739(2016)05-0005-04