赵 晨，付 莹，林华英，孙震晓（.北京中医药大学中药学院，北京 000；.中国海洋大学海洋生命科学学院，山东青岛 66003）

毛蚶抗癌活性蛋白对K562细胞增殖和凋亡的影响

赵 晨1，付 莹1，林华英2，孙震晓1
（1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.中国海洋大学海洋生命科学学院，山东青岛 266003）

目的考察毛蚶抗癌蛋白（ASAP）活性组分体外对人慢性粒细胞性白血病K562细胞的细胞毒作用，初步探讨其作用机制。方法 ASAP由毛蚶软体经常规低温水提和硫酸铵沉淀法制备；Bradford法测定ASAP样品的蛋白质浓度，计算蛋白质含量；倒置相差显微镜下观察ASAP作用后K562细胞形态变化，姬姆萨染色观察细胞和细胞核的变化；MTT法检测ASAP对K562细胞存活的影响；流式细胞术检测细胞凋亡和周期的变化；Western蛋白质印迹法检测细胞凋亡和细胞周期相关蛋白胱天蛋白酶原3（35 ku），胱天蛋白酶3（17 ku），程序性细胞死亡因子4（PDCD4）和P53的表达。结果 MTT实验结果表明，ASAP 50，100和200 mg·L-1作用24～72 h对K562细胞增殖具有明显的抑制作用，呈时间和浓度依赖性，24，48和72 h的浓度-效应相关系数分别为0.851，0.8977和0.8997（P＜0.01）。镜下观察发现，ASAP 200 mg·L-1作用48 h，K562细胞出现变形或核碎裂等形态变化。流式细胞术结合姬姆萨染色显示，ASAP可浓度依赖性地引起K562细胞凋亡和G2/M期阻滞，其中ASAP 200 mg·L-1处理48 h，K562细胞早期凋亡率为（32.8±0.1）%〔对照组（3.7±1.1）%〕（P＜0.01），晚期凋亡率为（31.2±2.2）%〔对照组（9.9±0.8）%〕（P＜0.01）；G2/M期细胞为（55.2±1.7）%〔对照组（15.3±0.8）%〕（P＜0.01）。Western蛋白质印迹法实验结果显示，ASAP作用0～40 h，K562细胞中胱天蛋白酶原3（32 h时）明显下调（P＜0.01），胱天蛋白酶3表达明显增加（P＜0.01），而随着ASAP作用时间的延长，PDCD4和P53蛋白表达均下调（P＜0.01）。结论 诱导K562细胞凋亡和G2/M期阻滞可能是ASAP细胞毒作用的主要机制；……