刘 伟郭思佳郝正华封继宏孙增涛△（.天津中医药大学第二附属医院，天津 30093；.天津中医药大学研究生院，天津 30093）

·研究报告·

清喉利咽颗粒联合养阴清肺糖浆止咳作用机制研究*

刘 伟1郭思佳1郝正华2封继宏1孙增涛1△
（1.天津中医药大学第二附属医院，天津 300193；2.天津中医药大学研究生院，天津 300193）

目的 探讨清喉利咽颗粒联合养阴清肺糖浆的止咳作用机制。方法 将实验SD大鼠随机等分为6组，即对照组、模型组、甘草合剂组、养阴清肺糖浆组、清喉利咽颗粒组、联合组，除对照组外均造感染后咳嗽模型，造模成功后给予相应药物灌胃，空白组给予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃。检测相关指标：通过氨水诱咳测大鼠咳嗽潜伏时间和3 min内咳嗽次数；通过HE染色法观察肺组织病理改变；收集支气管肺泡灌洗液（BALF），采用ELISA法检测BALF中细胞因子［白介素-4（IL-4）、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）］、神经肽P物质（SP）及降钙素基因相关肽（CGRP）的含量。结果 甘草合剂组、养阴清肺糖浆组、清喉利咽颗粒组以及联合组大鼠咳嗽次数均明显减少，BALF中SP，CGRP，IL-4，IL-8，TNF-α水平显著降低（P＜0.05），其作用效果由高到低依次是：养阴清肺糖浆联合清喉利咽颗粒、清喉利咽颗粒、养阴肺糖浆、甘草合剂。结论 养阴清肺糖浆联合清喉利咽颗粒能够明显抑制感染后咳嗽，其机制与减轻肺组织局部炎症反应有关。

感染后咳嗽 清喉利咽颗粒 养阴清肺糖浆

【Abstract】Objective：To study the mechanism of the effects of Qinghou Liyan granules with Yangyin Qingfei syrup on relieving a cough.Methods：Experimental SD rats were randomly divided into 6 groups，the control group，the model group，Gancao group，Yangyin Qingfei group，Qinghou Liyan group，and the combination group.All the other groups，except the control group，were made cough infection model.After the model was successfully made，the corresponding drugs were administered to the stomach.The control group was given equal volume of normal saline，once per day for 15 days.The following indicators were detected：Ammonia induced cough latent period and cough within 3 minutes，by HE staining to observe the lung pathological changes，collecting bronchoalveolar lavage fluid（BALF），ELISA method to detect in the BALF cell factor（IL-4，IL-8，TNF-α），neuropeptide substance P（SP）and Calcitonin gene-related peptide（CGRP）.Results：Gancao group，Yangyin Qingfei group，Qinghou Liyan group，the combination group can reduce cough times in rats.They can reduce the levels of SP，CGRP，IL-4，IL-8，TNF-αin the BALF.Its effect from high to low in turn is Qinhou Liyan granules with Yangyin Qingfei syrup，Qinghou Liyan granules，Yangyin Qingfei syrup，Gancao syrup.Conclusion：Yangyin Qingfei syrup and Qinghou Liyan granules can relieve cough caused by infection.The mechanism is related to the reduction of local inflammatory response in lung tissue.

【Key words】Post-infectious cough；Qinghou Liyan granules；Yangyin Qingfei syrup

清喉利咽颗粒来源于清代宫廷秘方 “宽膈利咽代茶饮”，原为御用清喉利咽之上品。养阴清肺糖浆是由治喉名方养阴清肺汤化裁而来，记载于清代名医郑梅涧的喉科专著《重楼玉钥》中。两中成药均为临床常用药，在治疗呼吸系统疾病上均有良好的疗效，经过多年的临床实践发现两药联合应用对于感染后咳嗽效果显著，且优于单独使用其中一种，然而其作用机制不明，本研究旨在初步两药联合应用的止咳作用及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠60只，6周龄，购自天津中医药大学动物房，体质量（150±20）g。清洁级饲养，室内温度保持在18～22℃，相对湿度50% ～70%，光照时间固定，每日照明时间为8∶00～20∶00。水、食物自由摄取。购入后适应性饲养1周进行实验。

1.2 试药与仪器 养阴清肺糖浆，由天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂提供。清喉利咽颗粒，由天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂提供；甘草合剂糖浆（100 mL/瓶，马应龙药业集团股份有限公司，批号140202）；大前门牌香烟（上海烟草集团公司出品）；辣椒素（北京邦顿特有限公司）；内毒素（25 mg/瓶，Sigma公司）；白介素-4（IL-4）、白介素-8 （IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、SP、CGRP酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Abcam公司）；电子天平（佛山顺德拓普域电子有限公司）；YLS-8A型多功能诱咳引喘仪（济南益延科技发展有限公司）。

1.3 分组及造模 将60只SD大鼠随机分为6组，即：对照组、模型组、甘草合剂组、清喉利咽组、养阴清肺组、清喉利咽联合养阴清肺组（联合组），每组10只。造模方法操作如下［1］：除对照组以外，其余各组大鼠均于特制的面积为0.5 m3的染毒箱内进行香烟烟雾暴露，每次10支香烟，每日1次，持续30 min，连续10 d，食水自由［2］。第11、14、17日用乙醚浅麻醉各熏烟组大鼠后，鼻腔滴入质量浓度为0.4 mg/mL的LPS溶液，滴入量以体质量1 μL/g计算，第12、13、15、16、18日，将该5组大鼠置于透明密闭容器中以1×10-4mol/L的辣椒素溶液雾化吸入激发，每次3 min，每日1次，每日观察各组大鼠状态，并于第19日开始对各组大鼠灌胃相应药物。对照组及模型组给予等体积0.9%氯化钠注射液；甘草合剂组予相应药物3.16 mL/kg；养阴清肺糖浆组予相应药物4.1 g生药/kg；清喉利咽颗粒组与相应药物4.1 g生药/kg；联合组予4.1 g生药/kg（按养阴清肺糖浆：清喉利咽颗粒质量比1∶1混合）。各组均给药每日1次，连续给药15 d于最后1次灌胃后24 h诱导各组大鼠咳嗽后处死各组大鼠测定相关指标。

1.4 标本采集与检测 1）大鼠咳嗽潜伏期和咳嗽次数测定：分别将大鼠放入YLS-8A型多功能诱咳引喘仪中，喷入27%氨水3 s，刺激大鼠咳嗽，自动记录各组大鼠咳嗽潜伏时间及3 min内咳嗽次数。2）支气管肺泡灌洗液中指标检测：将大鼠平放于手术台上将气管连同心肺游离出置于台上，用血管夹夹闭右主支气管，将顶端钝圆有孔的特制硅胶管插入气管，手术线结扎固定、左侧肺给予预温37℃的0.9%氯化钠注射液行支气管肺泡灌洗，反复抽推3次，留置1 min后回抽BALF并收集，重复3次，每次2 mL，每次回收液体置于冰块上，经过2层无菌纱布过滤于无菌离心管，回收计量 （回收率约75%）。1500 r/min低温离心l0 min，BALF上清保存在-80℃冰箱中，ELISA法检测IL-4、IL-8、TNF-α、SP及CGRP的含量。3）肺组织病理学观察：支气管肺泡灌洗完成后，迅速取下各组大鼠右肺，并取出右上叶修剪成0.5 cm厚的块状，置于4%多聚甲醛固定6 h，常规石蜡包埋切片，HE染色，观察大体组织病变和炎症细胞浸润情况。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠咳嗽次数比较 见表1。与对照组比较，其余各组咳嗽次数均增多（P＜0.05）；与模型组比较其余各组咳嗽次数均减少 （P＜0.05）；与甘草合剂组比较，养阴清肺糖浆组差异无统计学意义（P＞0.05），清喉利咽颗粒组、联合组咳嗽次数均减少（P＜0.05）；与养阴清肺糖浆组比较，清喉利咽颗粒组、联合组咳嗽次数均减少；与清喉利咽颗粒组比较，联合组咳嗽次数较减少（P＜0.05）。

表1 各组BALF中SP、CGRP、IL-4、IL-8、TNF-α含量比较（±s）

表1 各组BALF中SP、CGRP、IL-4、IL-8、TNF-α含量比较（±s）

与模型组组比较，#P＜0.05；与对照组比较，*P＜0.05；与甘草合剂组比较，△P＜0.05；与养阴清肺糖浆组比较，▲P＜0.05；与清喉利咽颗粒组比较，●P＜0.05。

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2.2 各组大鼠肺组织病理HE染色切片结果 见图1。对照组支气管和肺泡结构清晰，支气管上皮无脱落坏死，结构完整，气道黏膜上皮纤毛排列整齐，肺泡大小均匀，支气管、小血管周围无明显的炎细胞浸润。模型组可见支气管黏膜脱落，肺泡壁塌陷，肺泡腔不规则扩大，部分形成肺大泡，气道管壁周围及肺间质有炎细胞浸润，支气管黏膜皱璧增多，黏液增多。与模型组比较，甘草合剂组支气管管腔增厚，管腔伴黏液栓形成和平滑肌增厚、纤维组织增生不明显；周围肺组织伴较多炎胜细胞浸润较少。与甘草合剂组比较，联合组炎症细胞浸润及黏液分泌最轻，其次为清喉利咽颗粒组与养阴清肺组。

2.3 各组大鼠支气管肺泡灌洗液指标水平比较 见表1。与对照组比较，模型组、甘草合剂组、养阴糖浆组和清喉利咽组SP、CGRP、IL-4、IL-8、TNF-α均增高（P＜0.05）；与模型组比较，甘草合剂组、养阴糖浆组、清喉利咽组及联合组均降低（P＜0.05）；与甘草合剂组比较，养阴糖浆组、清喉利咽组及联合组水平均降低（P＜0.05）；与养阴清肺糖浆组比较，清喉利咽组及联合组水平均降低（P＜0.05）；与清喉利咽组比较，联合组具有显著差异（P＜0.05）。总之，甘草合剂、养阴清肺糖浆、清喉利咽颗粒及养阴清肺糖浆联合清喉利咽颗粒均能降低肺泡灌洗液中SP，CGRP，IL-4，IL-8，TNF-α的含量，其作用效果由高到低依次是：养阴清肺糖浆联合清喉利咽颗粒、清喉利咽颗粒、养阴清肺糖浆、甘草合剂。

图1 各组大鼠肺组织切片（HE染色，40倍）

3 讨 论

3.1 造模方法的选择 目前可用于建立咳嗽模型的动物众多，主要有兔、猫、犬、猪、豚鼠、大鼠、小鼠等［2］。本研究选用大鼠为实验动物，生命周期短而繁殖数量大，饲养、繁殖及药物使用的成本较低，在动物实验中使用较为普遍，宜用于大批量筛选实验。咳嗽的造模设计中，目前有机械刺激、化学刺激、电刺激及各类炎症介质介导等方法［3］。本实验选用烟雾吸入加化学刺激的方法，避免了机械刺激法只能在麻醉状态下进行且强度不能控制，无法定量的缺点［4］，是比较常用的方法，简便易行，耗药量少，易于掌握。有文献表明，革兰氏阴性菌是呼吸道感染中主要的致病菌之一，LPS是决定革兰氏阴性菌致病力的关键毒素［5］。李飞侠等研究表明，不同浓度的LPS滴鼻均能引起大鼠气道反应性增高，咳嗽反应性增强，但浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL的LPS引起的该反应可更显著地体现气道炎症改变，而肺实质则无明显炎症表现［6］。此外，本研究制作的感染性大鼠咳嗽模型，对辣椒素刺激敏感，咳嗽反应性均较空白组明显增高，为进一步研究细菌感染引起咳嗽的发病机制和治疗提供了研究基础和有效手段。

3.2 方药联合应用 养阴清肺糖浆由生地黄、麦冬、玄参、川贝母等药物组成，针对肺阴亏耗引起的内伤咳嗽，尤其是治疗伴有咽喉干燥疼痛、少痰或无痰的咳嗽效果较好［7］。方中重用生地黄甘寒入肾，滋阴壮水为君药，玄参滋阴降火，解毒利咽；麦冬养阴清肺共为臣药，佐以川贝母、甘草滋阴润肺止咳，白芍、牡丹皮清热凉血，薄荷疏风清热利咽，诸药共奏滋阴清热、润肺止咳、清热利咽之功，此方补虚为主，邪正兼顾，养肺胃之阴以扶其正；凉血解毒，散邪利咽以祛其邪。

清喉利咽颗粒由黄菩、西青果、梧梗、竹茹、胖大海等药物组成，主要用于急慢性咽炎扁桃体炎，咽喉发干，声音嘶哑及咽部异物感等症状，有保护声带的作用［7］。其中黄芩、西青果等7种清热药物可清热解毒，祛邪利咽；枳壳、香附等6种理气药物可理气化痰散结，改善病变部位的微循环，使腺体功能恢复，分泌物增加，可明显改善咽干症状；桑叶疏风清热，利咽止咳，有抗菌消炎的作用，桔梗宣发肺气、载药上行，紫苏子、紫苏梗、沉香肃降肺气，五药升降同调，共奏清热利咽，理气止咳，宽胸润喉之功［8］。梁永智等应用清喉利咽颗粒治疗99例慢性咽炎患者，表明其可直接作用于咽喉病变部位，缓解水肿，减少充血，修复黏膜损伤，进而达到治愈慢性咽炎的目的［9］。

临床上两药常联合应用，取得了良好的疗效，养阴清肺糖浆以滋养肺肾之阴为主，清喉利咽颗粒以清热解毒、驱邪利咽为要，二者治疗角度一内一外，一里一表，二者同用，在调理脏腑的同时，加用理气祛风之药，表里互动，标本兼施，具有协同作用，疗效自然显著。

3.3 治疗机制 目前普遍认为感染后咳嗽是临床上常见的疾病，通常引起患者不同程度的刺激性咳嗽，严重影响患者生活质量，咳嗽迁延不愈会引起支气管炎，哮喘等其他疾病。气道高反应性是咳嗽的主要原因之一，而气道高反应性是气道炎症是基础，IL-4能调控单核细胞释放细胞因子，最终增加炎性细胞的浸润和活化［10］。IL-8是趋化性细胞因子超家族的一员，可趋化和激活中性粒细胞、T淋巴细胞，促使其脱颗粒，产生多种炎性介质，TNF-α是巨噬细胞分泌的肽类炎性介质，可以诱导各种细胞因子的产生，使气道产生炎性改变，增高气道反应性［11］。感染后咳嗽的发病机制尚不明确，有研究认为支气管肺C纤维兴奋，释放其含有的神经肽，最终导致神经源性炎症是感染后咳嗽的重要发病机制［12-15］。本研究中发现养阴清肺糖浆、清喉利咽颗粒、养阴清肺糖浆联合清喉利咽颗粒、甘草合剂都能降低肺泡灌洗液中的SP、CGRP、IL-4、IL-8、TNF-α的含量，这说明养阴清肺糖浆、清喉利咽颗粒、养阴清肺糖浆联合清喉利咽颗粒、甘草合剂不仅能降低气道炎症反应从而降低气道高反应性最终减轻咳嗽，同时能降低神经源性炎症，减轻咳嗽。降低气道炎症反应与降低神经源性炎症可能是养阴清肺糖浆、清喉利咽颗粒、养阴清肺糖浆联合清喉利咽颗粒、甘草合剂治疗感染后咳嗽的两大机制。

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The Mechanism Research of the Effect of Qinghou Liyan Granules with Yangyin Qingfei Syrup on Relieving a Cough

LIU Wei，GUO Sijia，HAO Zhenghua，et al.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjian，China.

·研究报告·

r285.5 文献标志码：A

1004-745X（2016）08-1465-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.003

国家自然科学基金项目（30672681）；天津市高等学校“中医药防治呼吸病研究创新团队”资助项目（TD12-5036）

（电子邮箱：szt20042@eyou.com）

2016-04-17）