杨　飞,孙莹莹,李中皓, 边照阳,唐纲岭, 王　颖, 刘珊珊,邓慧敏, 范子彦, 张艳革

(国家烟草质量监督检验中心, 河南 郑州　450001)



研究报告(074～079)

液液萃取结合分散固相萃取-液相色谱串联质谱检测食品包装纸中的4-氨基偶氮苯

杨飞,孙莹莹,李中皓, 边照阳,唐纲岭, 王颖, 刘珊珊,邓慧敏, 范子彦, 张艳革

(国家烟草质量监督检验中心, 河南 郑州450001)

采用高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)快速测定食品包装纸中偶氮染料释放的4-氨基偶氮苯. 试样在0.5 mol/L氢氧化钠溶液的碱性环境下，用连二亚硫酸钠还原试样中的偶氮染料，用甲基叔丁基醚反萃取还原裂解产生的4-氨基偶氮苯，经氮吹、甲醇复溶后，用液相色谱-串联质谱进行测定，内标法定量. 方法优化了色谱分离、质谱、液液萃取和分散固相萃取等条件. 最优化条件下方法的检出限为0.13 mg/kg, 定量限为0.42 mg/kg，加标回收率在90%～95%之间(添加水平分别为1、 10、 30 mg/kg)，相对标准偏差小于5%.

4-氨基偶氮苯；液相色谱-串联质谱；液液萃取；分散固相萃取；包装纸

食品接触材料在生产加工过程中，为改良其性能，常需加入大量的添加剂. 着色剂可以赋予和改变食品接触材料的颜色，起到美化和装饰的作用. 但是倘若着色剂使用不当，或者使用劣质的着色剂则有可能给消费者的健康安全造成隐患. 欧盟议会和理事会(EC)No 1935/2004法规其通用要求中提到：任何拟与食品直接或间接接触的材料和制品必须足够稳定，以免引起其向食品迁移的物质量大到足以危害人类健康，或导致食品成分发生不可接受的变化，或引起食品感官特性的劣变. 欧盟法规最新公布的(EU)No.10/201l对总迁移量和特定物质迁移量分别给出了限量要求. 该法规在附件2明确规定在塑料材料和制品中初级芳香胺的迁移量不得超过0.0l mg/kg[1]. 而初级芳香胺的重要来源之一就是塑料原料中使用的含有偶氮染料的着色剂，在一定条件下发生分解而形成[2-3]. 偶氮染料常用于皮革、纸张、木材、麦秆、羽毛等的染色以及油漆、油墨、塑料、食品等的着色. 部分偶氮染料与人体的代谢产物(如汗液等)作用会产生对人体有致癌作用的初级芳香胺，这类偶氮染料称之为禁用偶氮染料[4]. 目前国际上明令禁止使用的芳香胺有24种，4-氨基偶氮苯(4-amino azo benzene)是其中的一种. 判断样品中是否使用了会释放出4-氨基偶氮苯的偶氮染料，需要在碱性条件下进行还原反应，通过检测还原液中是否含有4-氨基偶氮苯进行判断[7-11].

分散固相萃取法操作简单、快速、稳定，已广泛应运于农药、塑化剂、兽药等的检测[12-17]. 目前采用分散固相萃取-液相色谱串联质谱法测定芳香胺尚未见报道. 本文采用液液萃取结合分散固相萃取-液相色谱串联质谱法检测了食品包装纸中的4-氨基偶氮苯. 串联质谱技术(MS/MS)具有多离子反应监测(multiplereaction monitoring，MRM)功能，特征母离子或特征母离子经碰撞诱导解离产生的特征子离子可作为某一目标化合物定量的质谱指纹，可有效去除基体杂质干扰，相对于高效液相色谱(HPLC-DAD)法和单级质谱(GC-MS或LC-MS)法，是一种灵敏度更高、选择性更好、特异性更强的方法. 本研究中，我们将样品还原分解后，使用叔丁基甲醚对还原液进行液液萃取，然后用C18柱进行分散固相萃取净化，最大限度的减少杂质对目标物干扰，与固相萃取相比，提高了偶氮染料的检测速度. 本方法操作步骤比固相萃取法简单，在取得满意回收率和去除杂质的同时，有利于样品中芳香胺的检测.

1　试验部分

1.1仪器与试剂

API 4000四极杆串联质谱仪(美国ABI公司)，配备电喷雾电离源(ESI)；1200系列高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配ZORBAX C18柱(Φ5 μm,250 mm×2.1 mm, 美国Agilent公司)；离心机(Sigma 3-30K，德国Sigma公司)；涡旋振荡仪(VX200，美国Labnet公司)；恒温水浴锅(HH-8，江苏金坛)；氮吹浓缩仪(TurboVap, 美国caliper).

4-氨基偶氮苯和D9-4-氨基联苯(纯度均大于98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer)；甲基叔丁基醚、甲醇、醋酸(色谱纯，美国TEDIA公司)；水为超纯水(美国 Milipore 公司)；无水硫酸钠、氢氧化钠(AR). 30个食品包装纸样品(包括卡纸10个、铜版纸10个、真空铝纸10个)购买于市场.

1.2内标溶液的配置

准确称取10 mgD9-4-氨基联苯，精确至0.1 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的内标储备溶液. 移取内标储备液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为10.0 μg/mL的内标溶液，备用.

1.3标准工作溶液配置

称取10 mg 4-氨基偶氮苯，精确至0.1 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制质量浓度为1.0 mg/mL的一级标准储备溶液. 移取标准储备液100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，配制质量浓度为10.0 μg/mL的二级标准储备溶液.

根据样品实际含量配制合适浓度的系列标准工作溶液，推荐如下配制方法：分别准确移取0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL二级标准储备溶液于6个10 mL 棕色容量瓶中，加入50 μL内标溶液，用甲醇定容，即得系列标准工作溶液，现配现用. 配制的系列标准工作溶液质量浓度为20、50、100、200、500、1 000 ng/mL.

1.4LC-MS/MS检测条件

色谱柱：ZORBAX C18柱(柱长250 mm，内径4.6 mm ，固定相粒径5 μm)；流动相：甲醇(A)和0.1%(体积分数)甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序：0～2 min, 10%～60% A; 2～5 min, 60%～90% A; 5～10 min, 90% A; 10～11 min, 90%～10% A; 11～15 min, 10% A；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL.

质谱扫描方式：正离子扫描；电喷雾离子源(ESI)；雾化气流量：0.41 MPa; 气帘气流量：0.07 MPa; 辅助加热气流量：0.41 MPa; 离子化温度：500 ℃; 碰撞气流量：0.07 MPa; 4种气体均为氮气; 停留时间：30 ms; 电离电压：5 500 V, 正离子MRM模式采集，MRM参数如表1所列.

表1　质谱参数

* 定量离子对.

1.5样品的提取和净化

1.5.1还原反应[7]

称取0.5 g样品，精确至0.1 mg，置于50 mL具塞离心管中，加入15.0 mL氢氧化钠溶液、1.0 mL连二亚硫酸钠水溶液. 加塞振摇使液体混匀且浸透样品，于(40±2)℃水浴中放置 30 min 后，将离心管置于冰水浴中，于2 min内冷却至室温.

1.5.2萃取

在冷却后的离心管中分别加入50 μL内标溶液、10 mL甲基叔丁基醚和适量的无水硫酸钠，以2 000 r/min涡旋振荡5 min，然后以8 000 r/min离心3 min，将上层有机相全部转移至25 mL储液管中. 在离心管中再次加入10 mL甲基叔丁基醚，涡旋振荡5 min，离心3 min，取出上层有机相，并与第一次有机相合并. 混合液充分混匀后，取10 mL上层有机相于15 mL离心管中，加入50 mgN-丙基乙二胺(PSA)和150 mg Na2SO4，涡旋振荡2 min. 过滤后，取2 mL的滤液，氮吹至尽干. 用1 mL的甲醇复溶，进LC-MS/MS分析.

2　结果与讨论

2.1质谱条件的优化

质谱检测条件优化是为了保证被测离子能够具有较好地灵敏度和稳定性. 注入1.0 μg/mL 的标准溶液，经过单极质谱全扫描方式发现4-氨基偶氮苯和内标溶液在甲醇/水、乙腈/水等流动相中主要形成[M+H]+的母离子. 为了获得最佳的定性定量质谱参数，本试验采用仪器自带的优化软件Optimizer 对碎裂电压、碰撞能量、MRM离子对进行优化，得到的最佳MRM采集参数如表1所列.

2.2萃取溶剂及萃取方式选择

芳香胺的萃取溶剂一般为甲基叔丁基醚、乙醚、正己烷等. 正己烷回收率明显低于乙醚和甲基叔丁基醚. 乙醚与甲基叔丁基醚回收率结果相近，3种纸张中4-氨基偶氮苯的检测平均回收率在80%～95%之间，但是乙醚中含有过氧化物成分，使用前必须除去过氧化物，操作耗时费力，而且由于乙醚易燃，试验中存在一定的安全隐患，因此本方法选用叔丁基甲醚作为提取溶剂.

2.3提取次数的选择

通常萃取过程一般需多次提取，以保证得到较高的回收率. 通过对大量实际样品的检测发现，其中4-氨基偶氮苯的质量分数一般在20 mg/kg以下，本试验中样品添加水平为30 mg/kg. 以甲基叔丁基醚为萃取剂，比较了一次提取、二次提取和三次提取的回收率，结果显示，一次提取平均回收率达到75%左右，二次提取以后平均回收率达到90%，三次提取平均回收率没有明显的变化. 因此本试验选择二次提取法.

2.4提取方式的选择

振荡提取是液-液萃取分析中的重要环节. 试验采用3种振荡方式，即手摇2 min、涡旋振荡5 min和10 min，比较了这3种震荡方式对回收率的影响. 结果显示，手摇2 min的回收率略低. 为了尽量在不影响回收率的前提下提高检测效率，本方法采用涡旋振荡5 min的振荡方式.

2.5盐析试剂的选择

液-液萃取分析中，两相分别为水相和有机相. 但是有机溶剂和水不是绝对的不互溶，叔丁基甲醚会有微量的分散在水相，加入少量的盐可以促进两相的分离. 本试验分别考察了NaCl、Na2SO4和MgSO4对萃取效率的影响，结果如图1所示. 由图1可以看出，Na2SO4效果最好，NaCl次之， MgSO4回收率最低. MgSO4与水反应放热，温度过高导致部分目标损失，从而回收率偏低，Na2SO4不仅可以起到盐析的作用，而且可以与水结合降低水含量. 因此本文选择Na2SO4作为盐析试剂.

2.6固相分散萃取剂的影响

液液萃取以后，萃取液中可能含有大量的杂质，比如油墨、色素等. 这些杂质不仅污染仪器，也给目标物的定性带来干扰. 为降低基质效应，减少基质干扰，提高方法的灵敏度，分别使用50 mg PSA+150 mg无水Na2SO4、50 mg C18+150 mg无水Na2SO4和50 mg石墨化炭黑+150 mg无水Na2SO4，对添加有4-氨基偶氮苯，其质量分数为30 mg/kg的样品进行优化，结果如图2所示. 由图2可见，石墨化炭黑回收率最低，原因可能是石墨化炭黑对4-氨基偶氮苯有一定吸附作用；50 mg C18+150 mg无水Na2SO4效果最好，4-氨基偶氮苯在3种纸张中的平均回收率达到90%. 因此，本试验选用了50 mg C18+150 mg无水Na2SO4作为分散固相萃取剂.

2.7回归方程及检测限

分别移取一定量的混合标准溶液，按照给定的方法进行操作，制备至少6个标准工作溶液，其浓度范围应覆盖预计检测到的样品含量. 对混合标准工作溶液进行色谱分析，即可得到标准曲线. 标准溶液的色谱图如图3所示.

首先以目标物和对应内标的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线及其回归方程，线性相关系数为0.999 8.取最低浓度标准工作溶液，做10次平行试验，计算标准偏差，以最低浓度样品信号的3倍标准偏差所对应的浓度为检出限，检出限为0.13 mg/kg，10倍标准偏差所对应的浓度为定量限，定量限为0.42 mg/kg，结果如表2所列 .

表2　方法线性范围、相关系数、检出限和定量限

2.8重复性和回收率

分别在不同空白纸张样品中加入3个不同质量分数(1、10、30 mg/kg)的标准工作溶液，每个样品分别测定5次，根据分析结果计算本方法的加标回收率及加标后测定值的相对标准偏差，结果如表3所列.

表3　方法重复性和回收率

2.9包装纸实际样品的测定

为了验证本方法的可行性，采用本方法优化后的条件对市售的30个样品进行了检测，个别样品检出4-氨基偶氮苯，检测结果如表4所列. 表4还列出了采用国标GB/T23344—2009方法[7]测定的结果，两种方法所得结果的相对标准偏差小于10%，表明本方法与国标方法没有显著性的差异.

表4　实际样品中4-氨基偶氮苯的质量分数

3　结论

针对目前国内外相关法律法规的限制要求以及我国包装纸的现状，建立了食品包装纸张中偶氮染料释放的4-氨基偶氮苯的液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)分析方法. 目标物线性关系良好(R2>0.99)，在3种质量分数(1、10和30 mg/kg)的加标水平下，平均回收率大于90%，相对标准偏差小于5%. 方法的样品前处理过程简单，易操作，适用于烟用纸张中可释放出4-氨基偶氮苯的日常检测.

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Determination of 4-Aminoazobenzene in Paper Packaging by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Combining with Liquid-Liquid Extraction and Dispersive Solid-Phase Extraction

YANG Fei, SUN Ying-ying, LI Zhong-hao, BIAN Zhao-yang, TANG Gang-ling, WANG Ying,LIU Shan-shan, DENG Hui-min, FAN Zi-yan, ZHANG Yan-ge

(ChinaNationalTobaccoQualitySupervision&TestCenter,Zhengzhou450001,China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometric(LC-MS/MS), method for the quick detection of 4-Aminoazobenzene released from azo dyes in food wrappers, has been established. Sodium dithionite was added to sodium hydroxide solution to reduce and decompose the possible azo dyes. The extract was analyzed by liquid chromatography with tandem mass chromatography for the quantification and confirmation after a liquid-liquid extraction and dispersive solid-phase extraction. The chromatographic separations were performed on a ZORBAX Eclipse XDB-C18 column with gradient elution. In this method the conditions of chromatographic separation, mass spectrum, liquid-liquid extraction and dispersive solid-phase extraction were optimized. The detection limit was 0.13 mg/kg and the quantification limit was 0.42 mg/kg under optimal conditions, the spiking standard recoveries were ranged from 90%～95% with relative standard deviations (RSDs) ≤5%.

4-Aminoazobenzene;HPLC-MS/MS;dispersive solid-phase extraction;liquid-liquid extraction;paper packaging

2016-01-25;

2016-04-06.

国家烟草质量监督检验中心科技创新项目(562015CA0090)

杨飞(1985-)，硕士，工程师，主要从事烟草化学检验研究,E-mail：yangfei0797@163.com

唐纲岭，E-mail：tglcttc@163.com.

O657.32

A

1006-3757(2016)02-0074-06

10.16495/j.1006-3757.2016.02.003