张泽生，王春龙，刘清岱，*，王宝林（.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；.天津岂均生物科技有限公司，天津300480）

扩增子测序技术分析红茶菌中优势微生物的研究

张泽生1，王春龙1，刘清岱1，*，王宝林2
（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津岂均生物科技有限公司，天津300480）

红茶菌作为一种传统健康保健饮品，由于发酵过程中需要多种微生物的参与，因此需要对混合菌种进行高效的分离鉴定。本文通过提取红茶菌中的基因组DNA，采用高通量测序的方法对16S rDNA和ITS的扩增子进行测序，实现对红茶菌中优势微生物的分析鉴定。通过对可操作分类单元进行丰度分析和物种分类树统计，最终得到主要的细菌组成为：醋酸菌89.11%，拟杆菌5.56%，颤螺旋杆菌1.77%；优势真菌组成为：酵母菌为93.48%，其中嗜酒假丝酵母61.76%，酵母菌Blastobotrys adeninivorans 30.97%；α多样性分析结果显示：测序数据较为合理，测序数据量大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

红茶菌；扩增子测序；16S；ITS

红茶菌是一种以糖茶水为原料，由醋酸菌、酵母菌等微生物共同发酵而制成的功能饮料，是一种纯天然的健康保健饮品［1-2］。目前对于红茶菌中混合菌种研究主要依靠传统的微生物平板培养方法，这限制了很多微生物物种的分离鉴定，并且依赖表观性状对物种进行鉴定也可能导致误认［3］。

扩增子测序就是通过PCR扩增，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的研究策略。16S rDNA是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标，采用16S rDNA扩增子测序是利用保守区设计通用引物进行PCR扩增，然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定，成为研究环境样品中微生物组成结构的重要手段［4-5］。而对ITS扩增子进行测序，可以实现环境微生物中真菌多样性分析。MiSeq测序系统采用边合成边测序的技术，每次运行最多能产生超过7 Gb的数据。目前采用MiSeq平台对16S rDNA和ITS的一个或多个高变区测序，具有测序深度高、利于鉴定低丰度群落物种以及费用低的特点，已成为研究微生物群落多样性的首选之策［6-7］。

本文通过提取红茶菌中的基因组DNA，采用高通量测序的方法对16S rDNA和ITS的扩增子进行测序，对红茶菌中微生物组成、种属关系、相对丰富度以及微生物的多样性进行了分析鉴定。

1　材料和方法

1.1原料

红茶菌：天津岂均生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细菌和真菌基因组DNA提取

CTAB法［8］：取1.5 mL红茶菌，离心收集菌体，加入567μL的TE缓冲液，震荡重悬细菌。然后，加入30 μL 10%SDS和15μL20mg/mL蛋白酶K，于37℃温育1h，直至细菌裂解完全。加入100 μL 5mol/L NaCl和80 μL CTAB NaCl溶液，65℃温育10 min。采用Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1，体积比）抽提，异丙醇沉淀DNA。70%乙醇洗涤沉淀1次后，将DNA溶于50 μL TE缓冲液，加入1 μL RNase A（10 mg/mL），4℃保存备用。采用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 ng/μL。

1.2.2PCR扩增和高通量测序

稀释后的基因组DNA为模板；根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物；使用New England Biolabs公司的使用高效和高保真的酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。细菌的引物对应区域：16S V4区引物为515F-806R；ITS1区引物为ITS1F-ITS2。真菌的引物对应区域：16S V4区引物为515F-806R；ITS1区引物为ITS1F-ITS2。在30 μL的PCR反应体系中加入15 μL的PhusionRHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、0.2 μmol/L的正向和反向引物和10 ng模板DNA进行反应。PCR反应程序：98℃预变性1 min，30个循环98℃变性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后72℃5 min。

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，对主带在400 bp～450 bp之间的样品进行进一步的实验研究。使用切胶回收试剂盒回收产物。使用建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用MiSeq进行上机测序。

1.2.3生物信息学分析

采用Illumina MiSeq/HiSeq测序平台得到的下机数据存在一定的低质量数据，会干扰分析的结果，因此在进一步分析前，需要对下机数据进行预处理，去除低质量数据去除切除引物序列，再次去除低质量数据引物不匹配、含、过短序列，最终得到的有效序列。

提取出每个操作分类单元（OUT）的代表序列后，用Uparse软件进行物种的分类。最后，用Qiime软件对样品复杂度指数进行分析，并绘制相应的曲线。

2　结果与分析

2.1红茶菌16srDNA和ITS序列的扩增

红茶菌16s rDNA和ITS序列的扩增见图1。

图1　红茶菌16s rDNA和ITS序列的扩增Fig.1　The amplified sequences of 16S rDNA and ITS of Kombucha

采用CTAB法提取红茶菌中微生物基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，琼脂糖电泳结果表明采用16S V4区引物和ITS1引物扩增都得到了目的条带，目的条带分子量约0.5 kb，表明16S V4区和ITS1区都能得到很好的扩增。

2.2测序信息OUT分析及物种注释

2.2.1OUT分析

为了研究样品的物种组成多样性信息，用Uparse软件［9］对所有样品的全部序列聚类，默认提供以97% 和95%的一致性将序列聚类成为可操作分类单元结果。在操作分类单元（OUT）构建过程中，对不同样品的有效序列数据，低频数的序列和序列注释数据等信息进行初步统计，16s rDNA扩增子序列总数为72 223；用于构建OTUs并且获得分类信息的Tags数目为69 092；ITS扩增子序列总数为16 790；用于构建操作分类单元并且获得分类信息的序列数目为16 217；两类微生物可操作分类单元数据量较大，满足发酵产物菌群物种注释的要求。

2.2.2物种注释

同一操作分类单元中的序列被视为是来源于某一个相同分类单元的序列，作为一个假定的分类单元。Uparse构建操作分类单元时会选取代表性序列（依据其算法原则，筛选的是操作分类单元中出现频数最高的序列），将这些代表性序列集合用RDP Classifier［10］与GreenGene数据库［11］对细菌进行物种注释分析，用Qiime中的Blast方法与Unite-INSDC数据库［12］对真菌进行物种注释分析。

根据物种注释结果，选取在门分类水平上最大相对丰度排名前十的门，生成的物种相对丰度分布柱形图，见图2。

图2　细菌和真菌的物种相对丰度图Fig.2　The chart of species relative abundance of fungus and bacteria

从图2（a）可以看出，细菌门水平上物种的相对丰度从上往下依次为：其他，脱铁杆菌门，梭杆菌门，醋杆菌门，放线菌，蓝菌，疣微菌门，柔膜菌门，拟杆菌门，变形菌，厚壁菌门。从图（b）可以看出，真菌门水平上物种的相对丰度从上往下依次为：其他，未分类，接合菌门，担子菌，子囊菌。

2.2.3特定物种分类树

基于样品的物种分类结果，筛选特别关注的物种进行物种分类树统计［13］，见图3。

图3　细菌和真菌的特定物种分类树Fig.3　The classification tree of specific species of fungus and bacteria

从图3中，可以看出，红茶菌中主要优势细菌组成为：醋酸菌89.11%，拟杆菌5.56%，颤螺旋杆菌1.77%，沃氏嗜胆菌0.84%，肠道细菌Akkermansia muciniphila 0.55%，脱硫弧菌0.54%，瘤胃球菌0.45%。优势真菌组成为：酵母菌为93.48%，其中嗜酒假丝酵母为61.76%，酵母菌Blastobotrys adeninivorans为30.97%；

2.3样品α多样性分析

α多样性用于分析样品内的群落多样性［14］，主要包含3个指标：稀释曲线，物种丰富度和群落多样性。用Qiime软件对样品复杂度指数进行计算并绘制的相应的曲线，以红茶菌中细菌为例，如图4。

从细菌和真菌的稀释曲线、Chao1指数曲线、香农指数曲线可以明显的看出，各曲线数值升高直至平滑说明测序数据较为合理，测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

图4　样品中细菌的α多样性分析Fig.4　Alpha diversity analysis of bacteria in the sample

3　结论

红茶菌是由醋酸菌、酵母菌等有益微生物共同自然发酵而成，难以实现工业化的大规模生产。由于红茶菌是多菌种发酵，因此优势菌群以及相关的含量等还没有系统全面的研究报道。随着分子生物技术的发展，尤其是第二代测序技术的出现，使得微生物组学的研究更加全面和准确，可获得全面、系统、结构化的微生物群落结构信息，为红茶菌的工业化生产应用奠定基础。

通过对红茶菌中细菌16S rDNA、ITS的扩增子进行测序分析，确定了样品中主要优势细菌组成为：醋酸菌89.11%，拟杆菌5.56%，颤螺旋菌1.77%；通过ITS的扩增子测序，结果表明主要优势真菌组成为：酵母菌为93.48%，其中嗜酒假丝酵母61.76%，酵母菌Blastobotrys adeninivorans 30.97%。从样品复杂度分析可以看出，测序数据较为合理，测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

本文采用扩增子测序技术方法对红茶菌中微生物的组成、种属关系、物种相对丰富度、群落多样性进行了鉴定分析，与传统的方法相比准确性高，稳定性好，应用范围广泛，可以为研究复合益生菌发酵饮料及发酵过程中优势菌群变化的方法提供参考。

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Study on Analysis of the Dominant Microorganisms in Kombucha by the Technology of Amplicon Sequencing

ZHANG Ze-sheng1，WANG Chun-long1，LIU Qing-dai1，*，WANG Bao-lin2
（1.Institute of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Qijun Biotechnology Co.，Ltd.，Tianjin 300480，China）

Study on the application of the amplification sequencing technology in the research of compound bacteria fermented beverage.Taking the Kombucha beverage as an example，throught the genomic DNA extraction in oral liquid of Kombucha，amplicon sequencing of 16S rDNA and ITS using the method of high-throughput sequencing of amplicons of sequencing to analysis and identification the dominant microbial in oral liquid of Kombucha.The classification and statistics of the species by the special species classification tree，finally got the main bacteria composition：Acetobacter was 89.11%，Bacteroides was 5.56%，Oscillospira was 1.77%.The main fungus composition：Yeast was 93.48%，of which Candida ethanolica was 61.76%，Blastobotrys adeninivorans was 30.97%.The result of Alpha Diversity analysis showed that：the sequencing data was more reasonable，the sequencing data amount was large enough，can reflect most of the microbial species information in the sample.The the application of the amplification sequencing technology has advantages in the analysis of the advantages of the compound bacteria fermented beverage and the detection of the content of probiotics.

Kombucha；amplicon sequencing；16S；ITS

2015-09-01

张泽生（1956—），男（汉），教授，博士，研究方向：天然产物活性成分。

刘清岱（1975—），男（汉），副教授，博士，研究方向：生物化学与分子生物学。