雷　琪，田　蜜（重庆广播电视大学文法学院农医教研室，重庆　400052）

HPLC法同时测定荨麻疹丸中3种有效成分的含量

雷琪＊，田蜜（重庆广播电视大学文法学院农医教研室，重庆400052）

目的：建立同时测定荨麻疹丸中芍药苷、黄芩苷和欧前胡素含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Alltima C18，流动相为甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V），流速为1.0 ml/min，检测波长为230 nm（芍药苷）、280 nm（黄芩苷）、300 nm（欧前胡素），柱温为30℃，进样量为10µl。结果：芍药苷、黄芩苷和欧前胡素的检测质量浓度线性范围为5.40～54.0 μg/ml（r=0.999 8）、11.29～112.9 μg/ml（r=0.999 7）、24.95～249.5 μg/ml（r=0.999 9）；定量限分别为5.4、11.2、30.0 ng，检测限分别为1.8、2.8、7.5 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2%；加样回收率分别为95.88%～98.33%（RSD=0.95%，n=6）、96.86%～99.96%（RSD= 1.20%，n=6）、98.07%～100.55%（RSD=0.92%，n=6）。结论：该方法简便、准确、专属性强、重复性好，可用于测定荨麻疹丸中黄芩苷、芍药苷和欧前胡素的含量。

荨麻疹丸；高效液相色谱法；芍药苷；黄芩苷；欧前胡素；含量测定

荨麻疹丸为卫生部颁布标准中药成方制剂第10册（WS3-B-1976-95）收载的中药复方制剂，由赤芍、黄芩、白芷、防风、白鲜皮、薄荷、川芎等多味中药材组成，具有清热祛风、除湿止痒的功效，临床上用于风、湿、热而致的荨麻疹、湿疹、皮肤瘙痒等疾病的治疗［1］。其中，黄芩有清热燥湿、泻火解毒的功能；赤芍具有清热凉血、活血祛瘀的功效。黄芩苷和芍药苷为该药的主要活性成分，原标准尚未建立该制剂中芍药苷、黄芩苷和欧前胡素的含量测定方法［2］；且目前也仅有对荨麻疹丸中芍药苷单独进行含量检测的文献，尚未有同时测定芍药苷和黄芩苷的研究。为了更好地控制该制剂质量，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定荨麻疹丸芍药苷、黄芩苷和欧前胡素的含量。

1　材料

1.1仪器

1200型HPLC仪，包括紫外检测器、Empower色谱工作站（美国Agilent公司）；KQ-300型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：250 W，频率：40 kHz）；AE-240型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；1852D型超纯水机（重庆摩尔制水设备有限公司）。

1.2药品与试剂

荨麻疹丸（吉林龙泰制药股份有限公司，批号：140204、131006、131101，规格：10 g/袋）；芍药苷对照品（批号：110736-201336，纯度：98%）、黄芩苷对照品（批号：110715-201216，纯度：94%）、欧前胡素对照品（批号：110826-201310，纯度：98%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：230 nm（芍药苷）、280 nm（黄芩苷）、300 nm（欧前胡素）；柱温：30℃；进样量：10µl。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液精密称取芍药苷对照品10.80 mg、黄芩苷对照品22.59 mg、欧前胡素对照品49.91 mg，分别各置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为单一对照品贮备液。精密吸取上述单一对照品贮备液各10 ml，置于20 ml量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得芍药苷黄芩苷、欧前胡素质量浓度分别为0.108 0、0.225 9、0.499 1 mg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液取样品适量，研细，取细粉约5 g，精密称定，取样品粉末适量，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定质量，超声处理30 min，放至室温，再次称定质量，用甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液按样品的处方工艺和配方比例制备缺芍药、黄芩和白芷的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3系统适用性与专属性试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10µl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞5.6，理论板数分别以芍药苷、黄芩苷和欧前胡素峰计均≥6 000，保留时间分别为11、15.8、17 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1　高效液相色谱图A.混合对照品；B.阴性对照；C.供试品；1.芍药苷；2.黄芩苷；3.欧前胡素Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.negative control；C.test sample；1.paeoniflorin；2.baicalin；3.imperatorin

2.4线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品液各0、0.5、1、2.5、5 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇制成黄芩苷（质量浓度分别为0、5.40、10.80、27.0、54.0 μg/ml）、芍药苷（质量浓度分别为0、11.29、22.58、56.45、112.9 μg/ml）、欧前胡素（质量浓度分别为0、24.95、49.9、124.75、249.5 μg/ml）系列对照品溶液。分别吸取上述系列对照品溶液各10 μl，按“2.1”项下方法进样测定，记录峰面积。以质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程与线性范围，详见表1。

2.5定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ）；当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD），详见表2。

表1　回归方程与线性范围Tab 1　Regression equations and linear ranges

表2　定量限与检测限Tab 2　Quantitation limit and detection limit

2.6精密度试验

取“2.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件重复进样测定6次，记录峰面积。结果，芍药苷、黄芩苷和欧前胡素峰面积的RSD分别为0.49%、0.55%、1.22%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：140204）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芍药苷、黄芩苷和欧前胡素峰面积的RSD分别为0.95%、1.24%、1.31%（n=6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.8重复性试验

取同一批样品（批号：140204）适量，共6份，研细，精密称定，置于50 ml量瓶中，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算芍药苷、黄芩苷和欧前胡素的含量，详见表3。由表3可知，本方法重复性良好。

表3　重复性试验结果（n=6）Tab 3　Results of reproducibility tes（tn=6）

2.9加样回收率试验

取已知含量的同一批样品（批号：140204）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再分别加入一定量的待测成分对照品适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表4。

2.10样品含量测定

分别取3批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算芍药苷、黄芩苷和欧前胡素的含量，结果见表5。

3　讨论

3.1检测指标的确定

现行质量标准中荨麻疹丸的鉴别和含量测定项，不能全面地反映该药品的质量。2015年版《中国药典》（一部）将黄芩苷、芍药苷和欧前胡素分别作为黄芩、赤芍和白芷药材的质量控制指标［2］。因此，本研究选择黄芩苷、芍药苷和欧前胡素作为荨麻疹丸的质量控制指标，采用HPLC波长切换检测的方法，同时对样品中黄芩、赤芍和白芷的主要有效成分黄芩苷、芍药苷和欧前胡素进行定量分析。

表4　加样回收率试验结果（n=6）Tab 4　Result of recovery test（n=6）

表5　样品含量测定结果（n=3，mg/g）Tab 5　Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3.2检测波长的选择［3-5］

笔者将黄芩苷、芍药苷和欧前胡素的单一对照品溶液分别在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果黄芩苷在280 nm波长处有最大吸收，芍药苷在230 nm波长处有最大吸收，欧前胡素在300 nm波长处有最大吸收。为保证各成分均有适宜的灵敏度，并减少干扰，本研究最终选择切换波长检测各成分。

3.3供试品溶液提取方法的选择

在供试品溶液的制备过程中，笔者考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇等溶液作为提取溶剂，并对超声提取时间（10、20、30、40 min）进行优选［6-7］。结果显示，甲醇提取率最高，且超声30 min后芍药苷、黄芩苷和欧前胡素已基本提取完全，故将样品提取方法确定为甲醇溶解后，超声提取30 min。

3.4流动相的选择

有不少文献报道了芍药苷、黄芩苷和欧前胡素含量测量的流动相［8-13］，笔者参考2015年版《中国药典》（一部）中赤芍、黄芩和白芷项下芍药苷、黄芩苷和欧前胡素的含量测定方法，对流动相进行了探索，比较了甲醇-水-冰醋酸（50∶19∶1，V/V/V）、甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）和乙腈-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）等多组流动相。结果显示，甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）为流动相时，3种成分的色谱峰分离均较好，出峰时间适宜，分离度好，色谱对称性较好。

3.5色谱柱的选择

本试验同时考察了4种品牌色谱柱Waters SunFireTMC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent HC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、DiamonsilTMC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分离效果，根据图谱的分离效果，最终选择色谱柱Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为本试验的色谱柱。

综上所述，本方法简便、准确、专属性强、重复性好，可用于测定荨麻疹丸中黄芩苷、芍药苷和欧前胡素的含量。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂：第十册［S］.北京：人民卫生出版社，1993：106.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：147.

［3］潘浪胜，吕秀阳，平东.赤芍中芍药苷提取工艺的优化［J］.天然产物研究与开发，2006，18（2）：105.

［4］张桂英，范广才.高效液相色谱法测定蒲公英口服液中芍药苷的含量［J］.中国医院药学杂志，2006，26（1）：98.

［5］张捷，谭生建，王欢，等.高效液相色谱法测定小二润肺止咳口服液中橙皮苷和黄芩苷的含量［J］.药物分析杂志，2010，30（8）：1 454.

［6］张诚贤，徐陆忠，朱佳茜，等.高效液相色谱法测定荨麻疹丸中黄芩苷的含量［J］.医药导报，2013，32（12）：1 649.

［7］张薇，朱智甲，张晗，等.液相色谱-串联质谱法测定白芷中3种香豆素［J］.分析实验室，2012，31（5）：104.

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［10］张小博，曹恒涛，王小艳.黄连上清片中黄芩苷与欧前胡素的含量测定方法研究［J］.中国执业药师，2015，12（9）：32.

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［12］戴红锋，尹庆锋，谢彤.UPLC法测定复方虎黄喷剂中虎杖苷、黄芩苷、欧前胡素［J］.南京中医药大学学报，2014，30（1）：88.

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（编辑：刘柳）

Simultaneous Determination of Three Components in Urticaria Pill by HPLC

LEI Qi，TIAN Mi（Dept.of Agriculture and Medicine，College of Humanities and Law，Chongqing Radio and Television University，Chongqing 400052，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of paeoniflorin，baicalin and imperatorin in Urticaria pill.METHODS：HPLC was performed on the column of Alltima C18with mobile phase of methanol-water-Phosphoric acid（55∶45∶0.2，V/V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 230 nm for paeoniflorin，280 nm for baicalin and 300 nm for imperatorin，column temperature was 30℃，and the volume injection was 10µl.RESULTS：The linear range was 5.40-54.0 μg/ml for paeoniflorin（r=0.999 8），11.29-112.9 μg/ml for baicalin（r=0.999 7）and 24.95-249.5 μg/ml for imperatorin （r=0.999 9），respectively；the linit of quantitation were 5.4、11.2、30.0 ng，the lirnit of detection were 1.8、2.8、7.5 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 95.88%-98.33%（RSD=0.95%，n=6），96.86%-99.96%（RSD=1.20%，n=6）and 98.07%-100.55%（RSD=0.92%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate with strong specificity and good reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of paeoniflorin，baicalin and imperatorin in Urticaria pill.

Urticaria pill；HPLC；Paeoniflorin；Baicalin；Imperatorin；Content determination

R917文献标志码A

1001-0408（2016）24-3437-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.39

＊讲师，硕士。研究方向：药理学与药物分析。E-mail：345746479@qq.com

2016-03-21

2016-06-06）