杜任生,庾永基,肖伟明

(广州市花都区第二人民医院检验科　510850)



碳青霉烯类非敏感肠杆菌的耐药性与基因型研究

杜任生,庾永基,肖伟明

(广州市花都区第二人民医院检验科510850)

目的研究碳青霉烯类非敏感肠杆菌的耐药性与基因型。方法自2013年6月至2014年6月采集碳青霉烯类非敏感肠杆菌共计110株，选用K-B纸片分析细菌对药物有无敏感性，采用改良后的Hodge试验分析碳青霉烯细菌在临床上的使用反应。测试菌株耐药基因对BLAST对比(局部序列比对)与PCR、DNA进行分析测试。结果测试出替加环素中介11株和耐药4株(黏质沙雷菌、产气肠杆菌2株)。110株碳青霉烯类非敏感肠杆菌对头孢噻肟和阿莫西林/克拉维酸耐药率最高，头孢他啶、四环素、复方磺胺甲噁唑、亚胺培南、厄他培南、环丙沙星、氨曲南等耐药率均为64.9%～88.4%；而妥布霉素、阿米卡星、呋喃妥因、头孢吡肟耐药率较低，为16.6%～40.1%；敏感率增高的为替加环素、米诺环素，分别为82．0%和86.6%。研究发现110株碳青霉烯类非敏感肠杆菌当中，检测出blaSHV-12、blaCTX-M-15、ESBLs、blaCTX-M-33等基因。在110株碳青霉烯细菌当中还检测出1株黏质沙雷菌，基因型号为blaKPC-2;改良后的Hodge试验77株阳性，检出率为70%。36株(32.7%)ESBLs呈阳性，5株阴沟肠杆菌(blaIMP-26)与1株产气肠杆菌(blaVIM-2)基因、31株大肠埃希菌。结论碳青霉烯肠杆菌的基因型主要有blaKPC-2基因、blaIMP-26基因、blaVIM-2基因。药敏结果显示碳青霉烯类肠杆菌科细菌对米诺环素和替加环素敏感率增高，临床用药时可根据患者病情进行合理选择，以达到控制感染的效果。

碳青霉烯类抗菌药物；耐药性；基因型；肠杆菌

近几年随着科技不断发展，临床上应用广谱β-内酰胺酶与Amp C酶的肠杆菌科细菌越来越广泛，对广谱β-内酰胺酶使用率也是不断增加。由于临床上经常使用碳青霉烯类抗菌药物进行抗菌治疗，随着时间推移，造成临床使用抗感染药物的困难逐年上升。目前。碳青霉烯类肠杆菌被国内外学者广泛关注[1-4]。为进一步研究碳青霉烯类肠杆菌基因型情况，采集本院感染菌株110株，分析碳青霉烯类肠杆菌抗耐药性与基因型。

1　材料与方法

1.1菌株自2013年6月至2014年6月收集本院临床标本当中分离的碳青霉烯类非敏感肠杆菌共110株，其中黏质沙雷菌10株、布氏柠檬酸杆菌1株、阴沟肠杆菌20株、大肠埃希菌62株、气肠杆菌14株、奇异变形杆菌1株、摩根摩根菌2株，实验过程中亚胺培南与厄他培南只要出现上述两种或两种以上细菌耐药即为非敏感菌株。产IMP-4型酶、KPC-2型酶肺炎克雷伯菌、TEM-5型、肺炎克雷伯菌ATCC700603酶肺炎克雷伯菌、IMI-1型酶阴沟肠杆菌、SHV-3型酶。

1.2试剂与仪器血琼脂平板、M-H肉汤、血液增菌培养基、M-H琼脂均为杭州天微生物公司生产。PCR检测试剂盒为北京天根公司生产。阿米卡星、环丙沙星、头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶/克拉维酸、阿莫西林/克拉维酸、妥布霉素、四环素、头孢噻肟/克拉、维酸头孢他啶、氨曲南、亚胺培南、米诺环素、药敏纸片头孢吡肟、呋喃妥因、替加环素、复方磺胺甲噁唑，以上产品均为上海生工公司生产。本次使用的VITEK-33全自动微生物分析仪为SP1000 PCR扩增仪，Tanon1600凝胶成像系统以及DYY-Ⅲ电泳仪。三羟甲基氨基甲烷(Tris) 、溴化乙锭和琼脂糖、乙二胺四乙酸(EDTA)使用试剂盒均由上海天能公司生产。

1.3方法

1.3.1鉴定细菌及药敏试验本次采用菌株经VITEK-32全自动微生物分析仪进行鉴定，根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)使用K-B纸片检测菌株的药物敏感性[5]。

1.3.2检测碳青霉烯本次检测KPC-2型酶肺炎克雷伯菌显示为阳性对照株，按照GLSI标准进行改良的Hodge试验。

1.3.3扩增产物测序及 DNA 序列分析本文的扩增引物根据文献[6-8]设计,委托上海生工公司合成。本次检测PCR扩增产物使用ABI-PRISM3730仪器进行测试，对检测出的GenBank与BLAST数据进行分析,试剂使用配套试剂，操作过程完全按照仪器和试剂的说明书进行。

1.3.4ESBLs检测使用2013年版CLSI推荐的纸片法表型确证试验[5]。

2　结　　果

2.1药敏试验结果实验数据显示，本次测试出替加环素中介11株和耐药4株(黏质沙雷菌、产气肠杆菌2株)。本次试验耐药率为93.9%，显示110株碳青霉烯类非敏感肠杆菌对与头孢噻肟和阿莫西林/克拉维酸耐药率最高，头孢他啶、四环素、复方磺胺甲噁唑、亚胺培南、厄他培南、环丙沙星、氨曲南等耐药率均为64.9%～88.4%；而妥布霉素、阿米卡星、呋喃妥因、头孢吡肟耐药率较低，为16.6%～40.1%；敏感率增高的为替加环素、米诺环素，分别为82．0% 和 86.6%。

2.2ESBLs与MHT检测结果本次从110株碳青霉烯类非敏感肠杆菌细菌当中测出产碳青霉烯酶细菌77株(70%)、阴沟肠杆菌15株(19.5%)、黏质沙雷菌6株(7.8%)。77株产碳青霉烯酶细菌中大肠埃希菌49株(63.6%)、产气肠杆菌5株(6.5%)。36株ESBLs细菌。数据显示同时产ESBLs和碳青霉烯酶两种酶的细菌为18株，占16.6%。见表1。

表1　　数据分析110株碳青霉烯类非敏感肠杆菌科细菌碳青霉烯酶与ESBLs的检出率[n(%)]

2.3耐药酶基因检测及序列测定结果110株碳青霉烯类非敏感肠杆菌中，分别有33株(30%)、1株(0.9%)、5株(4.5%)检出blaVIM-2、blaKPC-2、blaIMP-26等碳青霉烯酶基因；分别有9株(8.6%)、5株(4.5%)、1株(0.9%)检测出blaCTX-M-3、blaSHV-12、blaCTX-M-15等ESBLs基因。62株大肠埃希菌中有31株(50.0%)检出blaKPC-2基因，检测出有8株携带blaSHV-12基因、1株携带blaCTX-M-15基因。20株阴沟肠杆菌中，有5株携带blaIMP-26基因、1株携带blaVIM-2基因、1株携带blaCTX-M-3基因、3株携带blaSHV-1基因。14株产气肠杆菌检出含blaKPC-2与blaSHV-12基因各1株。未从柠檬酸杆菌中检测出GIM、SIM、GES、NDM-1、IMI、OXA、SPM等基因。除以上检出基因还检出10株黏质沙雷菌、1株布氏柠檬酸杆菌、2株摩根摩根菌、1株奇异变形杆菌、1株blaKPC-2阳性、blaCTX-M-15基因，以上检测未检出碳青霉烯酶以及ESBLs基因。详见图1。

注：M为DNA marker；1～5分别为blaKPC-2、blaIMP-26、blaVIM-2、blaSHV-12、blaCTX-M-15；6为阴性菌株。

3　讨　　论

本次研究数据显示110株碳青霉烯类非敏感肠杆菌中含有blaVIM-2、blaIMP-26、blaKPC-2这3种碳青霉烯酶耐药基因,阴沟肠杆菌基因主要有blaVIM-2、blaIMP-26，实验发现碳青霉烯类非敏感肠杆菌可产ESBLs，本次实验发现110株菌当中有16.6%的菌株同时生产碳青霉烯酶与ESBLs，研究发现ESBLs，主要以blaCTX-M-15为主，blaSHV-12、blaCTX-M-3两种基因为辅，主要分布于阴沟肠杆菌与产气肠杆菌。碳青霉烯类中介或耐药的肠杆菌科细菌以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、黏质沙雷菌等为主，这些细菌应作为医院感染防控的主要对象[6-7]。碳青霉烯类药物被认为是治疗肠杆菌科细菌感染较为有效的药物，但近年来，肠杆菌科细菌对此类药物的耐药率在逐年增加。耐药的主要机制是菌株产生碳青霉烯类水解酶(包括A、B和D类)，其次是 ESBLs 或头孢菌素酶合并外膜蛋白改变和(或)外排泵作用，导致碳青霉烯类抗菌药物敏感性下降甚至耐药[8-9]。研究发现碳青霉烯类非敏感肠杆菌敏感率低于厄他培南以及亚胺培南，造成的原因有可能是非碳青霉烯酶引起的，造成其敏感率降低的原因还需进一步研究。药敏结果显示碳青霉烯类肠杆菌科细菌对米诺环素和替加环素敏感率增高，临床用药时可根据患者病情进行合理选择，以达到控制感染的目的。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.054

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1673-4130(2016)16-2333-02

2016-03-05

2016-06-18)