徐　飞,　杨共强,　王俊美,　宋玉立,　田怀芹

(河南省农业科学院植物保护研究所, 农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室, 郑州　450002)



DON毒素在小麦赤霉病抗感品种麦穗组织中的积累分析

徐飞,杨共强,王俊美,宋玉立*,田怀芹

(河南省农业科学院植物保护研究所, 农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室, 郑州450002)

本研究采用单小花滴注和喷雾接种方法对3个抗病品种(‘望水白’、‘苏麦3号’、‘扬麦16’)和3个感病品种(‘周麦18’、‘矮抗58’、‘豫保1号’)的赤霉病抗性进行分析,并用ELISA测定了籽粒、颖壳和穗轴中的DON毒素水平。结果表明:两种方法接种后第20天,除‘望水白’外,抗病品种的病级日扩展速率和病小穗率都显著低于感病品种(P<0.05);单小花滴注接种条件下,除‘周麦18’的籽粒和‘矮抗58’的穗轴外,抗病品种的籽粒、颖壳、穗轴中的DON毒素含量显著低于感病品种的籽粒、颖壳、穗轴中的DON毒素含量(P<0.05);而喷雾接种条件下,抗病品种与感病品种的籽粒、颖壳中的DON毒素含量差异不显著,而穗轴中的DON毒素含量差异显著(P<0.05)。除个别情况外,6个品种中,籽粒中DON毒素水平<颖壳中DON毒素水平<穗轴中DON毒素水平(P<0.05)。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇;小麦品种;赤霉病

小麦赤霉病(Fusariumheadblight，FHB)是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearumSchwabe)引起的小麦上的重要真菌病害,在北美洲、欧洲和亚洲广泛流行[1]。我国19世纪中后期,小麦赤霉病在长江中下游麦区和东北春麦区普遍发生,在黄淮海麦区和北方冬春麦区仅零星发生。其中黄淮海麦区是我国冬小麦主要种植区[2]。但近年来,小麦赤霉病在黄淮海麦区也流行成灾。小麦赤霉病不仅使小麦产量损失10%～50%,而且病菌产生真菌毒素污染籽粒,危害人畜健康[2]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是禾谷镰刀菌产生的一种主要毒素,也称呕吐毒素。培育和利用抗赤霉病和DON毒素积累的品种是防治小麦赤霉病、减轻DON毒素危害最为经济、有效和安全的措施[2]。

小麦对赤霉病的抗性包括抗侵染、抗扩展、抗DON毒素积累和抗籽粒侵染。‘望水白’、‘苏麦3号’和‘扬麦16’是小麦抗赤霉病育种中常用的抗源材料[3]。前人对其抗侵染和抗扩展能力的研究较多[4],对发病籽粒中DON积累水平也有报道[5],但是对麦穗组织抗DON积累能力了解较少。本研究旨在明确小麦赤霉病抗性品种和感病品种在两种接种方法下籽粒、颖壳以及穗轴中DON毒素积累水平,以及DON毒素水平与病程曲线下的面积(AUDPC)和病粒率之间的关系,为病害控制提供科学依据。

1　材料和方法

1.1材料

供试小麦品种共6个,其中3个抗病品种:‘望水白’、‘苏麦3号’和‘扬麦16’;3个感病品种:‘周麦18’、‘矮抗58’和‘豫保1号’。均由河南省农业科学院植物保护研究所小麦病害研究组提供。

供试菌株:6株禾谷镰刀菌菌株(FX3-1-4、FX3-2-6、FX4-2-3、FX4-3-4、JZ2-1-4和XH1-3-11)由本研究组提供,并于前期工作中鉴定出其毒素化学型均为15ADON,菌株从田间的小麦赤霉病病穗上分离并进行单孢纯化,PDA试管保存于4℃的冰箱中。

1.2方法

1.2.1田间种植

于2012年10月在河南省焦作市温县黄庄镇西虢村金地种业有限公司种植基地将供试6个小麦品种分别播种,每品种5行,行长 1.0m,行距0.3m,每行播10g,按常规措施进行田间管理。

1.2.2禾谷镰刀菌混合分生孢子悬浮液的制备

将4℃保存的禾谷镰刀菌菌株在新鲜的PDA平板上活化,25℃黑暗条件下培养3d,打取10块(5mm)边缘菌丝块转接到150mL的羧甲基纤维素酯液体培养基(CMC)中,置于恒温摇床上,25℃ 150r/min摇培5d,每个菌株2瓶(培养基用量150mL/瓶)。分别将供试菌株的分生孢子悬浮液用双重纱布过滤,用血球计数板计数,用无菌水调整分生孢子浓度为5×105个/mL用于田间接种,然后将6个菌株的分生孢子悬浮液等体积混合。单小花滴注接种和喷雾接种使用的分生孢子悬浮液浓度分别为5×105个/mL和5×104个/mL。

1.2.3田间接种和病害调查

于小麦扬花初期(2013年5月3日),分别采用单小花滴注法和喷雾法接种。单小花滴注法采用剪刀剪去麦穗中部小穗的内外颖壳顶部少许,滴入20μL镰刀菌分生孢子悬浮液,每个麦穗接种1个小穗,每个品种接种15穗,5穗为1组,分别套透明塑料袋保湿并记录接种后的天气情况,3d后去掉保湿袋,于接种后第10天和第20天,参照徐雍皋等[6]的方法记录每穗的病级,计算各品种的病级日扩展速率和AUDPC：

式中，y10和y20分别表示接种后第10天和第20天的病级。

喷雾法接种采用禾谷镰刀菌分生孢子悬浮液喷雾,每平方米喷雾50mL,每个品种接种15穗,5穗为1组,分别套透明塑料袋保湿,于接种后第10天和第20天记录每穗的病小穗数和总小穗数,并计算病小穗率和AUDPC：

式中，y10和y20分别表示接种后第10天和第20天的病小穗率。

小麦成熟后,将两个接种方法每个处理的病穗分别装入网袋,晾干后4 °C冰箱中保存。进行麦穗组织的DON毒素含量测定前剥出病穗中小麦籽粒,并记录病粒数和总粒数,计算病粒率：

1.2.4DON毒素含量的测定和分析方法

将不同接种方法接种后收获的病穗中小麦籽粒剥出,在微型植物粉碎机中按籽粒、颖壳、穗轴分别研磨,过20目筛后装入不同的自封袋中备用。每个样品粉碎后,严格清理粉碎机以避免相互污染。称取样品粉末置于50mL离心管中,加入5倍质量的蒸馏水,用力振荡3min并使用WhatmanNo.1滤纸过滤,收集滤液,然后稀释10、100、1 000和10 000倍备用。

使用RIDASCREEN®DON酶联免疫法呕吐毒素定量检测试剂盒(R-Biopharm,购于北京科明雷德科技有限公司)检测样品中DON毒素,操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行。标准样品浓度为0、3.7、11.1、33.3、100μg/L。在酶标仪上同时测定标准样品和待测样品在450nm处的吸光度,每个样品测定3次重复。当滤液中DON毒素浓度过大或者过小而超出检测范围时,使用其不同倍数的稀释液。

使用R-Biopharm(德国拜发公司)的应用软件RIDA®SOFTWin(Z9999)进行结果评估。并按照单次检测的Logit/log曲线进行分析,然后计算3次检测结果的平均值。

2　结果与分析

2.1不同小麦品种(系)对赤霉病的抗性

单小花滴注接种谷镰刀菌后第10天和第20天,3个抗性品种的平均病级日扩展速率为0.09和0.22, 3个感病品种的平均病级日扩展速率为0.18和0.36,除‘望水白’外,抗病品种与感病品种的病级日扩展速率和AUDPC都有显著差异(P<0.05)(表1)。喷雾接种后第10天和第20天,3个抗性品种的平均病小穗率为14.35%和29.23%,3个感病品种的平均病小穗率为32.52%和77.33%,接种10d后,抗病品种和感病品种的病小穗率差异不显著;接种20d后,除‘望水白’外,抗病品种与感病品种的病小穗率和AUDPC都有显著差异(P<0.05)(表2)。单小花滴注接种后,3个抗性品种的平均病粒率为9.98%,3个感病品种的平均病粒率为23.91%,3个抗性品种的病粒率显著低于感病品种‘矮抗58’的病粒率(P<0.05),而与感病品种‘周麦18’和‘豫保1号’的病粒率差异不显著(表1)。喷雾接种后,3个抗性品种的平均病粒率为8.11%,3个感病品种的平均病粒率为30.49%,除‘望水白’外,抗性品种的病粒率显著低于感病品种的病粒率(P<0.05)(表2)。

表1　单小花滴注接种后不同小麦品种赤霉病抗性指标和麦穗组织中DON毒素水平1)Table 1　Fusarium head blight (FHB) resistance indexes and deoxynivalenol (DON)levels ofselected wheat cultivars based on the single-spikelet drip inoculation

1) 表中同列数据后具有相同小写字母表示不同小麦品种所测指标差异不显著(P>0.05),同行数据后具有不同大写字母表示同一小麦品种的不同组织间的指标差异显著(P<0.05)。AUDPC表示病程曲线下的面积。病粒率表示发病籽粒占总粒数的比例。下同。

Thesamelowercaselettersinthesamecolumnsindicatenosignificantdifference(P>0.05)accordingtoFisher’sProtectedLeastSignificantDifferenceTest.Differentuppercaselettersinthesamerowindicatesignificantdifferencebetweentissuesofthesamecultivar.AUDPCistheareaunderFHBprogresscurve.PSKisthepercentageofscabbedkernels.Thesamebelow.

表2　喷雾接种后不同小麦品种赤霉病抗性指标和麦穗组织中DON毒素水平Table 2　Fusarium head blight (FHB) resistance indexes and deoxynivalenol (DON)levels ofselected wheat cultivars based on spray inoculation

2.2不同抗感小麦品种(系)籽粒、颖壳、穗轴中DON毒素含量

单小花滴注接种后,3个抗性品种的籽粒、颖壳、穗轴中的DON毒素含量平均值分别为1.59、11.89、35.78mg/kg,3个感病品种的籽粒、颖壳、穗轴中的DON毒素含量平均值分别为22.14、41.95、66.87mg/kg(表1)。抗病品种籽粒中DON毒素含量显著低于除‘周麦18’外其他2个感病品种籽粒中DON毒素含量(P<0.05);抗病品种颖壳中DON毒素含量显著低于感病品种颖壳中DON毒素含量(P<0.05);抗病品种穗轴中DON毒素含量显著低于除‘矮抗58’外其他2个感病品种穗轴中DON毒素含量(P<0.05)。

喷雾接种后,3个抗性品种的籽粒、颖壳、穗轴中的DON毒素含量平均值分别为1.92、8.02、12.59mg/kg,3个感病品种的籽粒、颖壳、穗轴中的DON毒素含量平均值分别为15.87、62.02、155.20mg/kg(表2)。3个抗病品种与3个感病品种的籽粒、颖壳中的DON毒素含量差异不显著,而穗轴中的DON毒素含量差异显著(P<0.05)。

另外,除喷雾接种后的‘望水白’、单小花滴注接种后的‘矮抗58’和‘豫保1号’外,抗性品种和感病品种籽粒中DON毒素含量<颖壳中DON毒素含量<穗轴中DON毒素含量(P<0.05)(表1～2)。

2.3DON毒素水平与AUDPC、病粒率间的关系

单小花滴注接种后,籽粒的DON含量与AUDPC的相关性系数为0.84(P<0.05),呈显著正相关,与病粒率不相关(P>0.05);穗轴和颖壳中DON含量与AUDPC和病粒率不相关(P>0.05)。喷雾接种条件下,籽粒、颖壳和穗轴中的DON含量与AUDPC和病粒率不相关(P>0.05)。

3　讨论

本研究评价了单小花滴注和喷雾法两种接种方法下,3个抗病品种和3个感病品种对赤霉病的抗性,并测定了麦穗不同组织中的DON含量,结果表明:(1)两种方法接种后第20天,除‘望水白’外,抗病品种的病级日扩展速率和病小穗率都显著低于感病品种(P<0.05),此结果与封薇等[5]报道的小麦品种抗病性与赤霉病发病程度有明显的正相关的结论相同。其中‘望水白’在本试验中的病级日扩展速率和病小穗率与感病品种没有显著性差异,与前人研究结果不相同[5,7],原因可能是与试验所用菌株、接种物浓度和接种后气候条件不一样造成。(2)单小花滴注接种后,除‘周麦18’的籽粒和‘矮抗58’的穗轴外,抗病品种的籽粒、颖壳、穗轴中的DON毒素含量显著低于感病品种的籽粒、颖壳、穗轴中的DON毒素含量(P<0.05),其中籽粒中DON含量与AUDPC呈显著正相关,此结果与徐飞等[8]的研究结果相同。但是喷雾接种后,抗病品种与感病品种的籽粒、颖壳中的DON毒素含量差异不显著,而穗轴中的DON毒素含量差异显著(P<0.05)。结果说明小麦品种的抗DON毒素积累能力受到不同接种方法的影响。(3)‘苏麦3号’抗扩展能力最强,作为亲本使用最为广泛[9];‘望水白’与‘苏麦3号’赤霉病抗性和抗DON积累能力没有显著差异(P>0.05),但是‘望水白’作为亲本,后代农艺性状差,所以至今还未育出大面积生产应用的抗赤霉病的小麦新品种。‘扬麦16’抗扩展能力与‘苏麦3号’相当,在喷雾接种后10d和20d的病小穗率以及AUDPC最低(表2),抗病性较强,且农艺性状好,可以作为抗侵染和抗DON毒素积累的抗源材料。

另外,本研究表明:除喷雾接种条件下的‘望水白’、单小花滴注接种条件下的‘矮抗58’和‘豫保1号’外,穗轴中DON毒素水平>颖壳中DON毒素水平>籽粒中DON毒素水平(P<0.05),两种接种方法结果一致,与Sinha等[10]对自然发病病穗的研究结果相同。

籽粒中的DON毒素积累少有两个原因：(1)籽粒形成过程中小麦植株产生降解DON的酶类;(2)在籽粒形成过程中,DON毒素转移至籽粒的效率低[3]。因此要研究不同小麦品种抗DON积累的原因,需要从上述两个方面进行分析,并选择合适的接种方法。

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[3]BaiGuihua,ShanerG.ManagementandresistanceinwheatandbarleytoFusariumheadblight[J].AnnualReviewofPhytopathology, 2004, 42: 135-161.

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(责任编辑：杨明丽)

Concentrationsofdeoxynivalenolinvarioustissuesofwheatheadsinresistantandsusceptiblevarieties

XuFei,YangGongqiang,WangJunmei,SongYuli,TianHuaiqin

(InstituteofPlantProtection,HenanAcademyofAgriculturalSciences，KeyLaboratoryofCropIntegratedPestManagementoftheSouthernofNorthChina,MinistryofAgricultureofthePeople’sRepublicofChina,Zhengzhou450002,China)

TheFHBresistanceofthreeresistantandthreesusceptiblevarietieswereinvestigatedbysingleflowerdripinoculationandsprayinoculationunderfieldconditions,andELISAwasappliedtoevaluatetheconcentrationofdeoxynivalenolinvarioustissuesofwheatheads.Theresultsshowedthatdailyspreadingrateofdiseasedegreeandpercentageofinfectedspikeletsinresistantvarietieswereobviouslylowerthanthoseinsusceptibleones(P< 0.05),except‘Wangshuibai’.DONlevelsofkernels,chaffandrachisinresistantvarietieswerealsoobviouslylowerthanthatinsusceptibleones(P< 0.05)bysingleflowerdripinoculation,exceptkernelsin‘Zhoumai18’andrachisin‘Aikang58’.ButtherewasnosignificantdifferenceinDONlevelsinkernelsandchaffamongresistantandsusceptiblevarietiesbysprayinoculation,exceptforrachis(P< 0.05).TheconcentrationofDONwashighestintherachis,followedbychaff,andthenkernels(P< 0.05).

deoxynivalenol;wheatcultivar;Fusariumheadblight

2014-12-16

2015-01-29

公益性行业(农业)科研专项(201303016)；“十二五”国家科技支撑计划(2011BAD16B07)；河南省小麦产业技术体系(S2010-01-05)

E-mail:songyuli2000@126.com

S435.121

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.022