朱威，饶雷平，赵登秋，王丛（岳阳市二人民医院，湖南岳阳44000；上海市第六人民医院；上海市公共卫生临床中心）

NS-398联合奥曲肽对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响及机制

朱威1，饶雷平2，赵登秋2，王丛3
（1岳阳市二人民医院，湖南岳阳414000；2上海市第六人民医院；3上海市公共卫生临床中心）

目的 探讨选择性Cox-2抑制剂NS-398和生长抑素类似物奥曲肽对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞株增殖、凋亡的影响及机制。方法 取对数生长期人胃癌SGC-7901细胞，随机分为空白组、对照组、NS-398组、奥曲肽组及联合用药组，空白组仅含培养液和等体积的DMSO，对照组为SGC7901细胞的单细胞悬液200 μL+等体积的DMSO，NS-398组给予NS-398 100 μmol/L，奥曲肽组给予奥曲肽10 μmol/L，联合用药组给予NS-398 100 μmol/L+奥曲肽10 μmol/L，分别培养24、48、72 h，采用CCK-8法检测各组胃癌SGC-7901细胞增殖抑制率，显微镜下观察细胞凋亡形态学变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率，实时定量荧光PCR及蛋白印迹法检测Cox-2蛋白表达。结果 干预后72 h，NS-398组、奥曲肽组、联合用药组SGC7901细胞增殖抑制率分别为（39.0±3.2）%、（41.3± 1.8）%、（78.8±1.4）%，联合用药组与NS-398组、奥曲肽组比较，P均＜0.01。显微镜下观察NS-398组、奥曲肽组、联合用药组可见典型的细胞凋亡形态改变，尤以联合用药组为著。NS-398组、奥曲肽组和联合用药组细胞凋亡率分别为（12.06±1.26）%、（19.87±1.45）%和（29.74±2.52）%，显著高于对照组的（2.13±0.28）%（P均＜0.01），联合用药组细胞凋亡率显著高于NS-398组、奥曲肽组（P均＜0.01）。NS-398组、奥曲肽组、联合用药组Cox-2表达均显著下降（P均＜0.01），尤以联合用药组降低更明显。结论 NS-398联合奥曲肽可协同抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能与下调Cox-2表达有关。

胃癌；NS-398；奥曲肽；细胞增殖；细胞凋亡

胃癌指发生于胃上皮组织的恶性肿瘤，为世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一［1］。临床以处于进展期的胃癌患者多见，手术根治率低，部分患者甚至无法手术切除，而化疗又存在一定不良反应及多重耐药性等缺点。近年发展起来的选择性环氧合酶2（Cox-2）抑制剂不仅使选择性地抑制Cox-2发挥抗肿瘤作用成为可能，且避免了传统NSAIDs由于同时抑制Cox-1而导致的不良反应。奥曲肽是人工合成的生长抑素类似物，通过与靶细胞上的生长抑素受体（SSTR）结合后发挥抗肿瘤作用。目前研究已证实选择性Cox-2抑制剂和生长抑素类似物对胃癌细胞SGC7901的增殖均有抑制作用［2，3］，但两种药物联用能否增强对胃癌的抑制作用研究较少。2013年6月～2014年6月，我们探讨了NS-398和奥曲肽对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞株增殖、凋亡的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌SGC-7901细胞株购于上海博谷生物科技有限公司。Cox-2抑制剂NS-398购自Sigma公司；奥曲肽购自瑞士诺华公司；RPMI1640培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS，Gibco公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所）；Annexin-FITC/PI双染色试剂盒（BD公司）；PrimeScriptTMRT Reagent Kit （Perfect Real Time）和SYBR Premix Ex TaqTM（宝生物工程大连有限公司）；Cox-2和GAPDH引物合成（上海博尚生物技术有限公司）；Cox-2多克隆抗体（兔来源）（Santa Cruz公司）。CO2细胞培养箱和酶标仪（Thermo公司）；倒置相差显微镜（Leica公司）；流式细胞仪（BD公司）；iCycler iQ多色实时PCR检测系统（Bio-rad公司）；蛋白SDS-PAGE电泳仪（Amersham Pharmacia Biotech）。

1.2 细胞增殖抑制率测算 采用CCK-8法。SGC-7901细胞用RPMI1640培养液加10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。实验取对数生长期细胞，胰酶消化，制成细胞悬液。取对数生长期的SGC-7901细胞，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/mL，接种于96孔培养板内，每孔200 μL，细胞贴壁后弃去培养液。将细胞随机分为空白组、对照组、NS-398组、奥曲肽组及联合用药组，空白组仅含培养液和等体积的DMSO，对照组为SGC7901细胞的单细胞悬液200 μL+等体积的DMSO，NS-398组NS-398浓度为100 μmol/L，奥曲肽组奥曲肽浓度为10 μmol/L，联合用药组NS-398浓度为100 μmol/L，奥曲肽浓度为10 μmol/L，每组设3个复孔。分别培养24、48、72 h，向各孔中加入10 μL的CCK-8溶液37℃下孵育4 h。酶标仪测定450 nm处的OD值。实验重复3次。根据各组OD值求得各组抑制率后，用金正均［4］法判断两药的相互作用，根据在量效曲线线性区内，两药合并用药的抑制率及两个单用药的抑制率，用以下公式计算q值：q值=两药合用的抑制率/两单药预计抑制率= E（A+B）/（EA+EB-EA×EB）。当q值=1±0.15时，两药有相加作用，q值＞1.15时，两药有协同作用，当q值＜0.85时，两药有拮抗作用。

1.3 细胞凋亡形态观察 取对数生长期细胞，NS-398、奥曲肽和联合用药组处理后继续培养24 h，于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化（显微镜放大倍数为100倍）。

1.4 细胞凋亡率测算 取对数生长期细胞，NS-398、奥曲肽和联合用药组处理后继续培养24 h，常规收集各组细胞，用胰酶消化细胞，将含细胞的培养液吸至离心管内，PBS离心、清洗2次，用预冷的结合缓冲液重悬细胞Annexin V-FITC和PI双染色法，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

1.5 胃癌细胞内Cox-2 mRNA表达检测 采用Real-time PCR法。取对数生长期细胞，NS-398、奥曲肽和联合用药组处理后继续培养24 h，常规收集各组细胞，TRIzol法提取总RNA，逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR反应体系测定Cox-2 mRNA表达，结果以GAPDH为内参计算相对值，实验重复3次，取平均值。

1.6 胃癌细胞内Cox-2蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期细胞，NS-398、奥曲肽和联合用药组处理后继续培养48 h，常规收集各组细胞。提取细胞中的总蛋白，BCA法测定Cox-2蛋白浓度，SD-PAGE电泳，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜上转膜成功后，用5%脱脂奶粉封闭2 h；加一抗，Cox-2多克隆抗体以1∶500稀释，GAPDH单克隆抗体以1∶2 000稀释，4℃放置过夜。用PBS-T液洗涤3次，每次10 min。加二抗，振荡孕育1 h。用PBS-T洗涤3次，每次10 min。使用Image J图像分析软件测定蛋白条带积分光密度值，实验重复3次，取平均值。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NS-398和奥曲肽对SGC-7901细胞增殖的影响 见表1。药物的相互作用结果：q24 h=1.19，q48 h=1.20，q72 h=1.23。两药联用对SGC-7901细胞增殖有协同抑制作用，且呈时间依赖性。

表1 各组不同时点SGC-7901细胞增殖抑制率比较（%±s）

表1 各组不同时点SGC-7901细胞增殖抑制率比较（%±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与NS-398组及奥曲肽组比较，#P ＜0.01。

SGC-7901细胞增殖抑制率组别24 h48 h72 h对照组000 NS-398组14.3±3.1*27.2±1.9*39.0±3.2*奥曲肽组22.4±3.4*28.1±2.0*41.3±1.8*联合用药组39.5±2.8*#57.2±3.8*#78.8±1.4*#q 1.19 1.20 1.23

2.2 SGC-7901细胞凋亡形态改变 光镜下对照组SGC-7901胃癌细胞呈多边形或梭形，贴壁生长。NS-398组、奥曲肽组、联合用药组24 h后开始出现凋亡的形态学改变，表现为细胞悬浮、细胞胞体缩小、细胞膜皱缩，细胞核浓缩，部分细胞发生融合，细胞数量明显减少，联合用药组与NS-398组、奥曲肽组相比，上述改变更明显。

2.3 NS-398和奥曲肽对SGC-7901细胞凋亡的影响 SGC-7901细胞被干预24 h后，NS-398组、奥曲肽组、联合用药组、对照组细胞凋亡率分别为12.06%±1.26%、19.87%±1.45%、29.74%± 2.52%、2.13%±0.28%，NS-398组、奥曲肽组、联合用药组与对照组比较，P均＜0.01；NS-398组、奥曲肽组与联合用药组比较，P均＜0.01。

2.4 NS-398和奥曲肽处理对SGC-7901细胞Cox-2 mRNA表达的影响 NS-398组、奥曲肽组、联合用药组、对照组Cox-2 mRNA的相对表达量分别为23.069±2.033、19.763±2.168、6.133±0.554、52.913±4.723，NS-398组、奥曲肽组、联合用药组与对照组比较，P均＜0.01；NS-398组、奥曲肽组与联合用药组比较，P均＜0.01。

2.5 NS-398和奥曲肽处理对SGC-7901细胞Cox-2蛋白表达的影响 NS-398组、奥曲肽组、联合用药组、对照组Cox-2蛋白的相对表达量分别为0.318± 0.040、0.465±0.029、0.182±0.014、0.721± 0.027，NS-398组、奥曲肽组、联合用药组与对照组比较，P均＜0.01；NS-398组、奥曲肽组与联合用药组比较，P均＜0.01。

3 讨论

Cox-2是花生四烯酸（AA）转化为PGH2的限速酶，近年来研究表明，Cox-2在胃癌发生、发展中扮演重要角色，其作用机制可能包括促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，参与肿瘤血管生成，促进肿瘤侵袭及转移，抑制抗肿瘤免疫［5］。此外Cox-2还可通过参与致癌物代谢、影响细胞周期等途径参与胃癌的发生、发展。Cox-2抑制剂可能通过Cox-2依赖和非依赖途径发挥抗胃癌作用［6］。传统的Cox-2抑制剂非甾体类抗炎药可抑制Cox-2表达而诱导癌细胞凋亡，但同时可抑制Cox-1，有严重的不良反应。近年发展起来的选择性Cox-2抑制剂（如NS-398、塞来昔布等）使选择性地抑制Cox-2发挥抗肿瘤作用成为可能，且不良反应少。

奥曲肽是人工合成的生长抑素类似物，通过与靶细胞上的生长抑素受体（SSTR）结合后发挥抗肿瘤作用，但其确切机制尚不清楚，可能的机制［7］：①直接与肿瘤细胞表面的SSTR结合，通过多种信号传导途径，阻滞肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡；②与非肿瘤细胞表面的SSTR结合，并通过抑制多种促肿瘤生长的激素或细胞因子的释放，抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡。

本研究经CCK-8试验证实选择性Cox-2抑制剂NS-398联合生长抑素类似物奥曲肽对胃癌SGC7901细胞的增殖呈协同抑制作用，并随作用时间的延长而增强。采用流式细胞技术对细胞凋亡分析发现，NS-398和奥曲肽均能诱导SGC7901细胞凋亡，而两药联用能显著诱导胃癌细胞凋亡，具有协同作用。选择性Cox-2抑制剂和生长抑素类似物在胃癌细胞上虽有各自作用的靶点，但却有共同的信号通路，如转录活化蛋白1（AP-1）是炎症或肿瘤情况下调节Cox-2表达的重要转录因子。研究发现，选择性Cox-2抑制剂可抑制p38 MAPK的磷酸化，抑制c-fos和c-jun二聚体复合物与AP-1 DNA位点的结合，下调AP-1的活性，从而降低Cox-2表达［8］。而生长抑素类似物奥曲肽亦能通过抑制ERK-1/ ERK-2表达，进而抑制c-fos表达，降低AP-1结合DNA的能力，下调AP-1的活性［9］。当两者联用时，可能抑制AP-1 DNA结合活性加强，使Cox-2的表达下调至很低水平，从而更加有效地阻断了Cox-2促癌生长作用，发挥协同抗癌效应［10］。本研究结果显示，两药联用抑制胃癌细胞生长的机制可能与协同下调胃癌细胞内Cox-2表达有关。

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上海市金山区卫生计生委课题（GSKG-KTQN-2013-06）。

赵登秋（E-mail：zhaodengqiu@126.com）

2015-12-28）