黄克华，周国富,陈朗

(1.重庆市渝北区人民医院烧伤整形科，重庆　401120；2.川北医学院附属医院烧伤整形科，四川 南充　637000)



转化生长因子-β1与表皮生长因子在成人增生性瘢痕中的表达及意义

黄克华1，周国富2,陈朗2

(1.重庆市渝北区人民医院烧伤整形科，重庆401120；2.川北医学院附属医院烧伤整形科，四川 南充637000)

目的：初步探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)在成人增生性瘢痕发生中可能的作用，为临床防治提供一定的依据。方法：通过SP法定性和ELISA法定量检测TGF-β1和EGF在成人增生性瘢痕和成人正常皮肤中的表达情况。结果：TGF-β1、EGF在成人增生性瘢痕中呈高表达，二者在成人增生性瘢痕中表达水平呈正相关。结论：TGF-β1、EGF在成人增生性瘢痕中均呈高表达，TGF-β1和EGF在成人增生性瘢痕中的表达水平呈正相关，这为研究临床预防、治疗皮肤增生性瘢痕提供新思路。

成人增生性瘢痕；表皮生长因子；转化生长因子-β1

【Abstract】Objective：To investigate transforming growth factor-β1(TGF-β1)and epidermal growth facto (EGF)in adults hypertrophic scars occurred in possible role,to provide basis for clinical prevention.Methods：The expression of TGF-β1 and EGF in adult hypertrophic scar and adult normal skin was quantitatively detected by SP and ELISA methods.Results：TGF-β1,EGF in adults hypertrophic scars showed high expression,both expressed in adult hyperplastic scar levels were positively correlated.Conclusion：TGF-β1,EGF in adults hypertrophic scars showed high expression,TGF-β1 and EGF expression levels in adult hypertrophic scars were positively correlated,which provide new ideas for clinical prevention and treatment of skin hypertrophic scars.

人皮肤增生性瘢痕(hypertrophical scar,HS)是当其受到创伤后在其修复过程中以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分产生与沉积过多为特征的纤维代谢性疾病[1]，HS发病率4%～16%[2]。HS形成有众多细胞生长因子参与，包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等，其中TGF-β1是参与瘢痕形成的最具有代表性的细胞因子(cytokine,CK)之一[3]。EGF与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)结合后加强TGF-β在胶原形成中的作用。目前，有关TGF-β1和EGF在成人HS中的表达是否有相关性的研究较少，本实验用定性、定量分析成人正常皮肤组织和成人HS组织中二者的表达情况，初步探讨二者在成人HS发生机制中有无相关性，为临床防治HS提供一定帮助。

1　材料与方法

1.1组织标本

标本源于医院手术患者，为2014年3月至2014年8月手术切口HS和烧伤后HS，瘢痕病程12～30个月，瘢痕无感染、药物注射及放疗史，无免疫相关疾病及全身免疫治疗，身体其他部位无肿瘤；对照标本为成人正常包皮(表1)。

表1　临床组织标本资料

*P<0.05，正常皮肤与HS患者年龄比较；#P>0.05，HS中男性与女性患者年龄比较；△P>0.05，男性与女性患者中HS年龄比较。

1.2主要试剂和仪器

Abcam公司的Anti-TGFbeta1、Anti-EGF；福建迈新公司的浓缩型DAB试剂盒等；上海恒生科技生物有限公司的ELISA检测试剂盒(EGF、TGF-β1)。OLYMPUS荧光显微镜、电子照相机装置(日本)，台式高速冷冻离心机-0110105025 ZH(上海力申仪器有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1石蜡切片免疫组织化学法(SP法)标本用4%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋制成厚度2.5 μm连续切片，依次常规脱蜡水化，酒精梯度脱水，3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶，PBS液洗切片，微波炉中修复，PBS液冲洗，滴加第一抗体，孵育，PBS液中荡洗，滴加二抗中的A液、B液，再孵育，再置入PBS液中轻荡洗，显色，冲洗，终止显色，苏木素复染，返蓝，脱水，透明，封片，晾干。

1.3.2酶联免疫吸附测定(ELISA法)新鲜标本组织液氮碾磨成粉末，称重，匀浆，离心并分装冻存于-80 ℃冰箱，按照ELISA试剂盒操作程序依次稀释标准品、加样、温浴、洗涤、加酶(空白孔除外)、温浴、洗涤、显色、终止显色、测定计算终浓度。

1.4结果判定用IHS法

由两名病理科医生评分，在400倍显微镜下随机计数5个视野取平均值，根据阳性百分比分：0%～10%，计1分；11%～50%，计2分；51%～80%，计3分；81%～100%，计4分。根据阳性标记显色程度分：无染色，计0分；淡黄色，计1分；棕黄色，计2分；棕黑色，计3分。根据所得着色细胞数得分与染色强度得分的乘积作为最后结果(0～12分)：0～1分，为阴性(-)；2～4分，为弱阳性(+)；5～8分，为阳性(++)；9～12分，为强阳性(+++)。

1.5统计学分析

2　结果

免疫组织化学染色结果：(1)EGF的表达情况。正常皮肤中染色集于表皮基底层，位于细胞核及部分皮肤附件，真皮结缔组织内细胞染色少；HS内阳性染色主要分布于表皮基底层、棘层、表皮等，阳性染色细胞数目较多，染色强度明显，内皮血管细胞、真皮结缔组织中细胞、皮肤附件部分染色，如图1。EGF在正常皮肤与成人HS中的表达差异有统计学意义(χ2=9.404,P=0.024)(表2)。(2)TGF-β1的表达情况。正常皮肤中主要位于表皮角质形成细胞胞浆和表皮基底层，真皮层内极少有阳性表达；HS中阳性表达于表皮角质形成细胞、表皮基底层和真皮Fb、血管内皮细胞胞浆及皮肤附属器等，染色密度及强度较正常皮肤高，如图2。TGF-β1在正常皮肤与成人HS中的表达差异有统计学意义(χ2=7.942，P=0.047)(表3)，TGF-β1和EGF在HS中表达阳性率的相关性采用Spearman相关分析，结果提示二者在HS中表达具有正相关性(r=0.362,P=0.012)(表4)。(3)ELISA检测统计结果，EGF在正常皮肤和HS中的平均浓度分别是(196.29±7.29)、(237.57±14.43)pg/mL，差异有统计学意义(t=12.44，P=0.001)；TGF-β1在正常皮肤与HS中的平均浓度分别是(246.92±14.93)ng/L、(446.71±59.24)ng/L，差异有统计学意义(t=31.11，P=0.000)；TGF-β1和EGF在HS中浓度表达相关性采用Pearson相关分析，提示二者在HS中表达水平具有正相关性(r=0.330，P=0.017)。

表2 EGF在正常皮肤和HS中的表达比较

组别EGF表达分级n-++++++阳性率(%)正常皮肤211641023.81HS48191610360.42

表3　TGF-β1在正常皮肤和HS中的表达比较

表4TGF-β1与EGF在HS中免疫组化染色表达阳性率的相关性比较

TGF-β1EGF阳性阴性合计R值P值阳性26026阴性319220.3620.012合计291948

3　讨论

3.1TGF-β1与HS

HS是人皮肤遭受创伤(如手术、烧伤等)后以Fb过度增殖、ECM过度沉积为主要病理特征并过度愈合所致，TGF-β1参与创伤愈合中炎症反应、血管和Fb增生、胶原合成与分解以及新的ECM的重建[4]。皮肤表皮和真皮浅层受创缺失后，其深层真皮Fb增殖率较浅层真皮Fb增值率低，由此推测真皮深层的Fb可能是形成HS的主要细胞来源之一[5]。正常皮肤组织浅层的真皮Fb具有抗纤维化特性，而深层的真皮Fb的迁移率较低，合成蛋白能力强，细胞过度增殖，引起ECM过度沉积形成HS[6-7]。

TGF-β1是已被公认的具有最强促纤维化作用的细胞因子(cytokine,CK)，在创面修复愈合过程中持续高浓度、过度表达可能是瘢痕形成的主要原因之一[8]。当皮肤受创后，炎性因子及组织修复因子经TGF-β1趋化下向创面聚集，促Fb分裂和增殖，TGF-β1诱导金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitors of MMP-1，TIMP-1)合成下调MMP-9的表达，TGF-β1还抑制MMP2降解胶原，促进ECM过度沉积形成HS[9]。TGF-β1促进TIMPs合成而抑制MMPs表达，致胶原蛋白代谢失衡而异常增生[10-11]。TGF-β1在HS形成中刺激Fb增殖，并促进间质细胞向Fb转化[12]。TGF-β1刺激I、III型胶原蛋白、整合素等多种ECM合成、沉积，且刺激产生I型胶原致ECM沉积增加促进瘢痕形成[13]。

本实验免疫组织化学染色显示TGF-β1在HS中主要表达于表皮角质形成细胞、表皮基底层和真皮Fb、血管内皮细胞胞浆及皮肤附属器等，染色密度及强度较正常皮肤高，在正常皮肤和HS中的阳性表达率分别为19.04%和54.17%，差异有统计学意义。经ELISA定量检测表明HS组织中TGF-β1的浓度较正常皮肤组织中高，在正常皮肤和HS中分别为(246.93±14.93)ng/L和(446.71±59.24)ng/L，差异有统计学意义。与众多研究相似，表达强度与以往文献报道有差距，考虑与瘢痕年龄等因素有关。

3.2EGF与HS

EGF主由血小板、巨噬细胞等分泌，它和表皮细胞、Fb等胞膜上的EGFR结合，参与细胞的增殖、分化和迁移功能的调节，与创伤修复过程密切相关[14]，EGF家族中涉及创面修复的主要是EGF、TGFα、HB-EGF。体外试验中，EGFR活化后促进急性创面中表皮细胞增殖和迁移，表皮再生增强，EGF且能够以近分泌的方式作用于角质细胞，促角质细胞有丝分裂、增殖，进而促使表皮再生和创面抗拉强度[15]。但缺少TGF-β1时并不妨碍创面的愈合，这可能是EGF家族中的其他生长因子具有一定程度的补偿作用[16]。EGF对Fb的生长、增殖活性有明显的促进作用，抑制Fb的凋亡，且刺激胶原的合成、增殖和沉积，当EGF产生过量时促HS形成[17]。当皮肤受创后，创周ESCs增殖分化加快，同时经自身分泌或者促进周边细胞分泌多种CK(如EGF、FGF、TGF-β1等)，表皮细胞和Fb的生长、增殖加强以及I、Ⅲ型胶原的分泌增多，创面愈合增强[18-19]。有研究发现，瘢痕增生后期EGF含量稍降低，而Fb生长仍表现优势，故多数瘢痕不能自行消失[20]。本实验发现在某些HS标本中EGF表达并不明显，而HS外观显著，推测EGF的产生及生物学效应可能存在时向性、浓度依赖性等影响因素。

本实验免疫组织化学染色，EGF在HS中阳性染色细胞数目、强度较正常皮肤明显，在正常皮肤和HS中阳性表达率分别为23.81%和60.42%，差异有统计学意义。ELISA定量检测，EGF在HS与正常皮肤中的浓度分别为(237.57±14.43)pg/mL和(196.29±7.29)pg/mL，差异有统计学意义。这与系列研究结果相似，表明EGF在促进HS形成过程中起着重要作用。

3.3TGF-β1和EGF在HS中阳性表达的相关性

TGF-α和EGF是EGFR的两种天然配基，它们与EGFR竞争性结合后调节细胞增殖。通过TGF-β1 mRNA原位杂交和VEGF蛋白免疫组织学化染色观察，发现瘢痕组织中TGF-β1和EGF均明显增加促进创面上皮化及瘢痕形成[21]。本实验中免疫组织化学检测发现二者在HS中均呈明显高表达，且与正常皮肤中的表达差异有统计学意义，部分HS中TGF-β1和EGF的表达强度具有一致性。据此推测二者在瘢痕增生过程中可能相互正向调节促进其产生、协同发挥生物学效应促HS形成。TGF-β1作用于角质细胞，反过来角质细胞分泌EGF加强创面愈合，创面上皮化作用更明显。但缺少TGF-β1并不妨碍创面的愈合，这可能是EGF家族中的其他生长因子有一定程度的补偿作用[14]。EGF可促表皮细胞、Fb和其他细胞的增殖，促胶原合成与ECM过度沉积。TGF-β1对Fb生长具有双向调节性，即高浓度时呈现抑制，低浓度时表现为促进。创伤发生后，EGF和TGF-β1均增多，致创面组织Fb浓度增高，当增加到一定程度时TGF-β1增加速度放缓，但创面修复继续且过度修复而形成瘢痕，这可能是二者之间存在相关性并协同作用致部分瘢痕持续增生的原因之一。

本研究经免疫组织化学染色和ELISA分析发现，TGF-β1和EGF在成人HS中均呈高表达，且二者表达存正相关，两种检测表达的相关程度不完全一致(免疫组化时R=0.362,P=0.012；ELISA时R=0.330,P=0.017)，推测与检测方式、瘢痕标本个体差异等有关。由此推测EGF和TGF-β1在成人HS的发生、发展进程中存在正相关，二者生物学效应的叠加可能是促进HS形成、发展的机制之一。

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(学术编辑：肖文明)

Expression and significance of TGF-β1 and EGF in adult hypertrophic scar

HUANG Ke-hua1,ZHOU Guo-fu2，CHEN-Lang2

(1.Department of Burns and Plastic Surgery,The People’s Hospital of Chongqing Yubei District，Chongqing 401120;2.Department of Burns and Plastic Surgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,Sichuan,China)

Adult hypertrophic scar;Epidermal growth factor;Transforming growth factor-β1

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.027论著

四川省卫生发展研究中心项目(SJWF1311)

2015-06-19

黄克华(1975-)，男，硕士。E-mail：cq023hkh@163.com

周国富，E-mail：2508122390@qq.com

网络出版时间：2016-8-217∶48网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.054.html

1005-3697(2016)04-0548-05

R619.6

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