邓梦琴,何夏怡,何慕怡,宋贤良,黄　苇,林晓瑛

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)



响应面法优化菠萝蜜果皮黄酮提取工艺

邓梦琴,何夏怡,何慕怡,宋贤良*,黄苇,林晓瑛

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

采用乙醇浸提法从菠萝蜜果皮中提取黄酮,研究了液料比、乙醇浓度、提取时间和提取温度等对菠萝蜜果皮黄酮得率的影响并采用响应面实验设计和多元二次回归分析优化了此提取工艺。结果表明,乙醇浓度76%,料液比1∶22(g/mL),提取温度68 ℃,提取时间2 h为最佳提取工艺条件。验证实验得到黄酮提取量为23.512 mg/g且黄酮对DPPH自由基的清除能力与VC相当。各因素对菠萝蜜黄酮得率的影响次序是:提取温度>料液比>乙醇浓度>提取时间。因此,从菠萝蜜果皮中也能获得较高得率的黄酮,且该黄酮具有良好的抗氧化能力。

菠萝蜜,黄酮,提取,响应面法

菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.),又称“树菠萝”、“木菠萝”,是桑科(Moraceae)桂木属常绿乔木,素有“热带珍果”之称[1-2]。据统计,我国热带地区菠萝蜜种植面积达20万亩,并有数家果肉加工厂,但菠萝蜜可食用部分仅占果实的43.2%,而不可食的果皮果腱等约占40%[3],由于加工利用技术和相关研究的缺乏,大量菠萝蜜果皮被丢弃成为农业废料,造成极大的资源浪费和环境污染。因此,研究菠萝蜜皮渣的深加工及利用是提高农业综合生产能力与效益,保证农业生产健康持续发展的必要途径。

黄酮类化合物是植物的次级代谢产物,广泛分布于自然界中。大量研究表明,黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌消炎、改善血液循环等功效[4-6]。此外,黄酮作为天然色素、天然抗氧化剂等已广泛应用于食品工业[7]。近几年来,从植物中分离提取黄酮类化合物开发保健食品、化妆品的研究也较多[8-9]。目前,国内对菠萝蜜中的黄酮类物质研究甚少,多集中在菠萝蜜叶的黄酮物质研究[10,12],国外则侧重于对菠萝蜜根茎中黄酮物质研究[13-14]。本研究以菠萝蜜果皮为原料,采用有机溶剂浸提法提取黄酮类化合物,采用响应面法优化菠萝蜜果皮中黄酮的提取工艺条件,以期为抗氧化保健食品的开发和新型天然抗氧化剂的工业化生产提供理论依据,对提高菠萝蜜加工副产物的生态效益、经济效益和社会效益具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菠萝蜜皮广州市农贸市场;芦丁标准品上海源叶生物科技有限公司;氢氧化钠、氯化钠、氯化铝、亚硝酸钠、乙醇等试剂均为分析纯。

恒温水浴锅HH-4型,常州澳华仪器有限公司;紫外可见分光光度计752型,上海精密科学仪器有限公司;电热鼓风干燥箱202型,广州市富华测控科技有限公司;组织粉碎机FW100型,天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1提取工艺流程新鲜果皮清洗→烘干→粉碎→过筛(80目,-4 ℃冷藏备用)→溶剂提取→黄酮含量测定

溶剂提取过程:称取5.0 g样品置于250 mL锥形瓶中,加入一定体积分数的乙醇溶液,一定温度下浸提一定时间,流动水冷却至室温,抽滤,测量滤液体积,滤液以30%乙醇定容至100 mL容量瓶中备用。

1.2.2黄酮含量测定

1.2.2.1标准曲线绘制准确称取芦丁标准品10 mg,用70%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中(冷藏备用),分别准确吸取芦丁标准储备液0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10 mL于25 mL容量瓶中,加30%乙醇溶液至12.5 mL,加入5% 亚硝酸钠溶液 0.75 mL,摇匀,放置6 min。加入 10% 硝酸铝溶液 0.75 mL,摇匀,放置6 min。再加入1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL,用30%乙醇溶液定容,放置15 min,在波长510 nm处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.2.2样品含量测定取3.0 mL提取液于25 mL容量瓶中,按1.2.2.1方法显色,在510 nm处测定其吸光度,总黄酮含量计算公式如下:

Y=(C×V×D)/m

式中,Y-总黄酮提取量,mg/g;C-由标准曲线计算得出的待测试液的总黄酮质量浓度,mg/mL;V-待测试液的体积,mL;D-待测试液的稀释倍数;m-菠萝蜜果皮粉质量,g。

1.2.3单因素实验在固定料液比(g/mL)为1∶25、提取温度为70 ℃、提取时间为2 h的条件下,考察不同乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)对黄酮提取量的影响;在固定乙醇浓度为70%、提取温度为70 ℃、提取时间为2h的条件下,考察不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)对黄酮提取量的影响;在固定乙醇浓度为70%、料液比为1∶25、提取时间为2 h的条件下,考察不同提取温度(50、60、70、80、90 ℃)对黄酮提取量的影响;在固定乙醇浓度为70%、料液比为1∶25、提取温度为70 ℃的条件下,考察不同提取时间(1、2、3、4、5 h)对黄酮提取量的影响。

1.2.4响应面法工艺优化实验在单因素实验结果的基础上,固定提取时间2 h,采用Design Expert 8.0 Trial建立3因素3水平的Box-Behnken模型,通过实验确定最优提取工艺。以乙醇浓度、料液比、提取温度3个因素作为实验因素,黄酮提取量为响应值,自变量因素编码及水平见表1。

1.2.5DPPH法测定抗氧化活性参考陈海光等[15]的方法,稍有改动。将菠萝蜜果皮黄酮提取液稀释10倍作为待测液,测得黄酮类物质含量为0.153 mg/mL,以0.153 mg/mL的VC代替样品做阳性对照,做3次平行。其中抗氧化剂的清除自由基能力采用清除DPPH自由基的IC50值表示,即DPPH自由基清除率为 50% 时所对应的抗氧化剂溶液浓度。IC50值的测定通过根据不同浓度样品的清除率作曲线求出。所需浓度越低,表明半清除率越高,清除效果越好。待测样的DPPH自由基清除率按照以下公式进行计算:

式中,A0(对照):4.0 mL DPPH+0.5 mL无水乙醇;A1(反应):4.0 mL DPPH+样品溶液;A2(空白):4.0 mL无水乙醇+样品溶液。

表1　Box-Behnken设计实验因素水平及编码Table 1　Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters tested in Box-Behnken experimental design

1.3数据统计分析

采用SPSS 19.0软件进行方差显著性检验;采用软件 Design Expert 8.0 Trial对所得数据进行回归分析;采用origin7.5软件作图。

2　结果与分析

2.1黄酮含量测定标准曲线

由图1可看出,黄酮含量与吸光度呈线性关系。其回归方程为y=1.1451x+0.003,相关性R2=0.9994,结果表明,黄酮含量在0～0.04 mg/mL范围内线性关系良好。

图1　芦丁标准曲线Fig.1　The rutin standard curve

2.2单因素实验结果

2.2.1乙醇浓度对黄酮提取量的影响由图2可知,随着乙醇浓度的增加,黄酮类化合物的提取量也随之增大;乙醇浓度为70%时,提取液中黄酮含量最高,随着乙醇浓度的继续增加,黄酮含量反而随之减少。其原因可能是当乙醇浓度超过70%时,一方面会使提取粗品中杂质含量增加,有效成分反而降低,影响提取物的有效含量;另一方面也可能由于乙醇浓度过高导致挥发过大,同时一些醇溶性杂质,色素,亲脂性强的成分溶出量增加,与黄酮化合物竞争和乙醇结合,从而导致黄酮类化合物提取率下降。因此,乙醇浓度为70%时,黄酮类化合物的提取效果最佳。

图2　乙醇浓度对黄酮提取量的影响Fig.2　Effect of the alcohol concentration on the flavonoids extraction quantity

2.2.2料液比对黄酮提取量的影响由图3可知,随着料液比的增大,黄酮的提取量逐渐增加,而随着料液比的继续增大,菠萝蜜果皮中黄酮的提取量变化基本趋于平缓。当料液比为1∶25(g/mL)时,菠萝蜜果皮中黄酮类物质提取量相对最大。因为在一定范围内,料液比的增大可以增加溶剂和原料的接触效果,增大浓度差,有利于扩散速度的提高,从而可提高黄酮类化合物的浸出率。但当浸提溶剂量过多时,黄酮的提取量未见显著增多,继续增大料液比则不利于节能环保,节约成本。因此,提取的料液比选取1∶25(g/mL)为宜。

图3　料液比对黄酮提取量的影响Fig.3　Effect of the ratio of solid to liquid on the flavonoids extraction

2.2.3提取温度对黄酮提取量的影响由图4可知,菠萝蜜果皮中黄酮类化合物的提取量随着温度的升高呈现先增加后减小的变化趋势。当提取温度为50～70 ℃时,黄酮含量增加迅速,呈明显的上升趋势;当温度达到70 ℃时,黄酮的提取量最大;此后继续升高提取温度,黄酮含量明显降低,提取温度为80 ℃比70 ℃时黄酮提取量下降了17.97%。由此说明温度的适度提高对植物组织的浸润具有一定的促进作用,有利于有效成分黄酮的浸出,但是提取温度过高会破坏黄酮的化学结构,并可能增加其他杂质的溶出,进而使黄酮的提取率降低。因此,70 ℃是比较理想的提取温度。

图4　提取温度对黄酮提取量的影响Fig.4　Effect of the extract temperature on the flavonoids extraction

2.2.4提取时间对黄酮提取量的影响由图5可知,提取时间在1～2 h内,提取得到的黄酮类化合物提取量显著增加,提取时间为2 h时,黄酮类化合物的提取量最高。当提取时间超过2 h时,黄酮提取量却随之下降。这可能是因为黄酮类物质具有抗氧化性,其本身易被氧化破坏,过长时间暴露在外,尤其是高温提取时,其化学结构遭到破坏,最终使得黄酮提取率下降[16]。另外,提取时间越长,能耗等其他经济成本也越大。因此,选定2 h为菠萝蜜果皮黄酮类化合物的最佳提取时间。

图5　提取时间对黄酮提取量的影响Fig.5　Effect of the extract time on the flavonoids extraction

2.3响应曲面优化实验结果

2.3.1单因素方差分析利用SPSS 19.0软件对单因素的乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)4个因素进行方差分析(结果如表2),由表2可知,乙醇浓度差异显著(p<0.05);提取温度和料液比,差异极显著(p<0.01);而提取时间对黄酮提取量影响不显著(p>0.05),故由单因素实验结果方差分析可知,响应面法可固定提取时间为2.0 h。

表2　单因素方差分析Table 2　One-way analysis of variance

注:**表示p<0.01,极显著;*表示p<0.05,显著。

2.3.2回归模型的建立及统计检验响应曲面优化实验结果见表3。采用软件DesignExpert 8.0 Trial对所得数据进行回归分析,分析结果见表4。

表3　Box-Behnken实验设计结果Table 3　Experiment result of Box-Behnken

表4　回归方程系数显著性检验表Table 4　Test of significance for regression coefficient

注:**表示p<0.01,极显著;*表示p<0.05,显著。

由方差分析表4可知,此模型的p<0.01,响应面回归模型达到极显著水平,因此,这种实验方法是可靠的;方程的失拟项表现不显著(p=0.2703>0.05),说明表面模型回归拟合良好,各因素值和响应值之间的关系可以用此模型来函数化,此回归方程来可对实验结果进行分析预测。由表4中模型系数的显著性检验数据可知,提取温度的一次项对黄酮提取量的影响达到显著水平(p<0.05),二次项的影响呈极显著水平(p<0.01);溶剂浓度和料液比的一次项均未达到显著水平,而溶剂浓度的二次项则达极显著水平(p<0.01)。各因素的交互项对黄酮提取量的影响均有显著影响,A与B交互作用显著,B与C交互作用显著,A和C交互作用极显著,表明各影响因素与响应值的关系中,二次项和交互项对响应值有很大的关系。由F值可知,各因素对黄酮提取量的影响依次为:提取温度(C)>料液比(B)>乙醇浓度(A)。各因素对黄酮提取量的影响不是简单的线性关系,利用软件对表3中实验数据进行多元回归分析,得到各因子对黄酮提取量Y(mg/g)影响的二次多项回归模型:

Y(mg/g)=22.30+0.27A-0.46B-0.65C-0.87AB-2.07AC-0.95BC-1.28A2-0.45B2-2.38C2

式(1)

2.3.3因子交互效应分析由响应面模型(1)绘制响应面分析图,见图6至图8,各图显示溶剂浓度、料液比、提取温度中任意两个变量取零水平时,其余2个变量对黄酮提取量的影响。

图6　A和B交互作用曲面图Fig.6　A and B interaction surface figure

图7　A和C交互作用曲面图Fig.7　A and C interaction surface figure

图8　B和C交互作用曲面图Fig.8　B and C interaction surface figure

响应曲面坡度越陡峭,表明响应值对于操作条件的改变越敏感;反之曲面坡度越平缓,操作条件的改变对响应值的影响也就越小[10]。图6～图8 直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。由图6可知,当乙醇浓度一定时,随着料液比的增大,黄酮的提取量呈逐渐上升的趋势;而当料液比的增大到一定值时,黄酮提取量变化会趋于平缓。当料液比不变时,黄酮提取量随乙醇浓度的升高呈现先升高后缓慢下降的趋势。图7表明,当乙醇浓度保持不变时,随着提取温度的增加,黄酮的提取量先呈明显上升的趋势,在70 ℃以后则缓慢减少,当提取温度一定时,黄酮提取量先随乙醇浓度的升高而显著升高,当乙醇浓度较高时,呈现先增加后下降的趋势。图8结果显示,料液比不变时,随着提取温度的上升,黄酮提取量随着温度的上升而呈先增加后减少的趋势;当提取温度不变且处于较低水平时,随着料液比的增加,黄酮提取量变化不大;而当提取温度较高时,黄酮提取量呈缓慢的下降趋势。

2.3.4最优工艺参数及验证实验用Design-Expert 8.0软件对二次多项式回归方程进行计算求解,可得菠萝蜜果皮中黄酮提取工艺的优化值为:乙醇浓度75.73%,料液比1∶21.51,提取温度67.83 ℃,提取时间2 h,黄酮提取量为22.642 mg/g。为方便实验操作,菠萝蜜果皮中黄酮提取工艺的最佳参数均取整数,即乙醇浓度76%,料液比1∶22,提取温度68 ℃,提取时间2 h。在此条件下进行验证实验,黄酮提取量为23.512 mg/g,与理论预测值的相对误差为3.84%。

2.4DPPH自由基清除能力

DPPH·是一种化学性质较为稳定的以氮为中心的自由基,不易被清除,若受试物能够清除它,则表示受试物具有较强的自由基清除能力。从图9可知,菠萝蜜果皮黄酮对DPPH·自由基具有较强的清除能力,在较低的浓度下即可达到较高的清除率;随着黄酮含量的增大,清除能力增强,并呈现较好的量效关系,其清除能力与0.1 mg/mlVC对照液相比,呈现一致的变化趋势,且清除能力略低于等浓度的VC。经测得提取液的IC50=0.026 mg/ml,略大于VC的IC50=0.024 mg/ml。说明菠萝蜜果皮黄酮提取液具有较好的体外抗氧化能力。

图9　菠萝蜜果皮黄酮对DPPH·清除作用Fig.9　Scavenging effects of Jackfruit peel flavonoid DPPH· radical

3　结论

本实验以菠萝蜜果皮为提取原料,在单因素实验的基础上,采用响应面法(RSM)进一步优化提取工艺,建立了提取菠萝蜜果皮黄酮的二次多项数学模型,该模型极显著,且拟合情况良好。各因素对菠萝蜜果皮中黄酮提取量的影响次序为:提取温度>料液比>乙醇浓度>提取时间。最佳提取工艺条件为乙醇浓度76%,料液比1∶22(g/mL),提取温度68 ℃,提取时间2 h。此条件下黄酮提取量为23.512 mg/g。并通过测定其对DPPH自由基的清除能力来评价其体外抗氧化性,结果表明随黄酮含量增加,清除能力增强,测得其IC50为0.026 mg/mL,与VC的IC50=0.024 mg/mL对比,可以看出菠萝蜜果皮中的黄酮与VC有几乎持平的自由基清除率,说明其具有较好的体外抗氧能力。

菠萝蜜常用于鲜食,其中非可食部分的果皮占全果的比重大,通过对菠萝蜜果皮中黄酮物质的提取及其功能活性的研究,将为菠萝蜜的研究提供一个更广阔的开发应用途径。随着科学技术和消费理念的进步,果蔬植物中的天然活性物质的开发日渐成为研究热点,而菠萝蜜果皮的大量、廉价、易获取的特点,具有很大的待开发潜力。

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Optimization of flavonoids extraction from jackfruit peel by response surface methodology

DENG Meng-qin,HE Xia-yi,HE Mu-yi,SONG Xian-liang*,HUANG Wei,LIN Xiao-ying

(College of Food Science,South China Agricultural Unversity,Guangzhou 510642,China)

Flavonoids was extracted from jackfruit peel with the use of ethanol,and the effect of factors on the yield of jackfruit peel flavone was investigated,including liquid ratio,ethanol concentration,extraction time and extraction temperature. The response surface experiment design and multiple quadratic regression analysis were ordered to optimize the extraction technology.The results showed that the optimum conditions was as follows:76% ethanol concentration,solid-liquid ratio and(g/mL),extraction temperature 68 ℃,extracting time 2 h. Flavonoids extraction quantity iof 23.512 mg/g was obtained from verified experiment,and the DPPH free radical scavenging capacity of flavonoids was equal with vitamin C. Nevertheless,the influence order was:extraction temperature>solid-liquid ratio>ethanol concentration>extraction time.Therefore,relatively high flavonoids yield was achieved from jackfruit peel,and the flavonoids had a favourable antioxidant capacity.

Jackfruit;flavonoids;extraction;response surface methodology

2015-08-04

邓梦琴(1991-)，女，硕士，研究方向：食品加工，E-mail:dmq503592509@163.com。

宋贤良(1969-)，男，博士，副教授，从事食品加工新技术的研究，E-mail:songx12000@163.com。

公益性行业(农业)科研专项(201303077)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)05-0222-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.035