阳　晖,赵学勤,李昌满,孙钟雷,李　宇,李　敏,邓　鑫,胡　苇

(长江师范学院生命科学与技术学院,重庆涪陵 408100)



胭脂萝卜废渣中提取萝卜硫素的酶解工艺优化

阳晖,赵学勤,李昌满,孙钟雷,李宇,李敏,邓鑫,胡苇

(长江师范学院生命科学与技术学院,重庆涪陵 408100)

以胭脂萝卜废渣为原料,提取萝卜硫素。为提高萝卜硫素的得率,优化了胭脂萝卜废渣中萝卜硫苷的酶解条件。在单因素实验的基础上,以响应面分析法分别探讨了四个主要影响因素(酶解温度、酶解时间、pH、抗坏血酸(VC)添加量)对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响,并进一步优化了硫代葡萄糖苷酶解条件。结果表明:在酶解温度为31 ℃,酶解时间为7.7 h,pH5.6,VC添加量为0.24 mg/kg条件下,萝卜硫素的得率最高为0.05613%,其结果与模型预测值相符。这说明采用响应面法优化获得的提取条件较可靠。

萝卜硫素,酶解,胭脂萝卜废渣,响应面

萝卜硫素(又名莱菔子素),属于异硫代氰酸盐衍生物,其分子式C6H11S2NO,分子质量的大小为177.29[1]。它是萝卜硫苷经过内源性或外源性的黑芥子硫苷酶(葡萄糖硫苷酶)或者酸水解后产生的一类异硫代氰酸盐衍生物[2]。

图1　萝卜硫苷酶解生成异硫氰酸盐[2]Fig.1　Glucosinolates produced isothiocyanates by enzymatic hydrolysis[2]

萝卜硫素具有抗菌、抗癌、抗氧化和提高机体免疫力等药理作用,从而受到国内外学者的广泛关注[3-4]。大规模生产萝卜硫素产品不论是作为药品或是食品方面,都具有广阔的市场应用前景。目前,主要采用两种方式生产萝卜硫素,一种是酶法,另一种是化学合成法。化学反应条件很难控制,并且生产成本非常高,故很少采用化学法生产萝卜硫素[2,5-6]。现有的大多数研究都是从十字花科蔬菜或其种子中直接提取萝卜硫素前体,然后经水解获得萝卜硫素[2]。但由于萝卜硫素的本身含量较低,因此生产萝卜硫素需要消耗大量的原料,导致生产成本较高。

胭脂萝卜,十字花科萝卜属的草本植物,是重庆涪陵地区的三大特产之一。它皮心全红、富含萝卜红色素,是提取食用天然色素萝卜红素的理想原料之一[7]。然而,在红色素生产过程中会产生的大量萝卜废渣,这些废渣几乎全部被废弃,这不仅造成资源的浪费,还容易污染环境。如何将这些废渣变废为宝,是胭脂萝卜色素生产企业迫切需要解决的问题。

课题组研究发现这些萝卜废渣中不仅含有大量生成萝卜硫素前体物质-萝卜硫苷,而且还含有可以降解萝卜硫苷生成萝卜硫素的葡萄糖硫苷酶,因此,可以利用胭脂萝卜废渣来制备萝卜硫素。这不仅降低生产萝卜硫素的成本,而且还有利于胭脂萝卜废渣的循环利用,变废为宝,同时,为大规模开发萝卜硫素系列产品提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

胭脂萝卜废渣重庆丹青生物技术有限公司,废渣回收后,在-18 ℃冷冻保存。

二氯甲烷、抗坏血酸、溴甲酚绿、甲基红、六氢吡啶、盐酸、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠天津市化学试剂一厂,以上试剂均为分析纯。

ZSD-1090电热鼓风干燥箱上海智城分析仪器制造有限公司;303-3植物组织搅碎机江苏省车台县电器厂;RE-500旋转蒸发仪上海一凯仪器设备有限公司;SG2pH计梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;HH-4 数显恒温水浴锅江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2实验方法

1.2.1工艺流程萝卜废渣→匀浆→调pH、添加催化剂→酶解→干燥→提取→抽滤→旋转蒸发→粗提物→得率测定

1.2.2操作要点匀浆:按料液比为5∶2将水加入到萝卜废渣中,然后进行打浆。

pH调节、酶解:添加适量的VC作为催化剂,用磷酸缓冲液调节萝卜废渣的pH，在35 ℃水浴中酶解8 h。

干燥:酶解后的萝卜废渣,在40～50 ℃干燥。干燥的时间控制18～19 h,以基本无水分,呈粉末状为准。

提取、抽滤:按固液比为1∶30,在干燥后的萝卜废渣中加入萃取剂(二氯甲烷),超声波萃取30 min,在25 ℃,放置3 h。将萃取后的混合液抽滤2次,回收滤液,备用,提取3次。

旋转蒸发:将上述滤液在40 ℃旋转浓缩至无萃取剂为止,再用少量二氯甲烷将产物洗涤出来,最后用分液漏斗进行分离,获得萝卜硫素粗提物。

1.2.3测定方法采用滴定法对萝卜硫素粗提物进行测定[9]。

1.2.4单因素实验设计

1.2.4.1不同pH对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响添加0.2 mg/kg的VC,调节pH分别为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5,在35 ℃酶解8 h,测定萝卜硫素的得率。

1.2.4.2不同酶解时间对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响添加0.2 mg/kg的VC,然后调节pH为5.5,在35 ℃酶解0、4、8、12、16 h,测定萝卜硫素的得率。

1.2.4.3不同酶解温度对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响添加0.2 mg/kg的VC,然后调节pH为5.5,分别在15、25、35、45、55 ℃的水浴中酶解8 h,测定萝卜硫素的得率。

1.2.4.4不同VC添加量对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响分别添加0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/kg的VC,调节pH至5.5,在35 ℃酶解8 h,测定萝卜硫素的得率。

1.2.5响应面实验设计为了进一步探讨pH、酶解时间、酶解温度以及VC添加量对萝卜硫素得率的影响,以萝卜硫素得率为检测指标,在单因素实验的基础上,采用响应面实验,对主要影响因素进行进一步优化。响应面实验的水平、因素见表1。

表1　实验设计的水平及因素Table 1　Factors and levels of experiments design

1.2.6萝卜硫素得率的计算

1.3数据分析

用Excel和Design Expert 8.0统计分析软件进行数据处理。

2　结果与分析

2.1单因素实验结果与分析

2.1.1不同pH对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响不同来源的葡糖硫苷酶最适pH范围不同,在pH4～9之间均能找到活性最高的葡糖硫苷酶同工酶。不同pH对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响,结果见图2。

图2　pH对萝卜硫素得率的影响Fig.2　Effect of pH on yield of sulforaphane

由图2可知,pH对胭脂萝卜中葡萄糖硫苷酶活性影响很大。过低或过高的pH都会降低硫苷酶的活性,甚至使得酶失去活性,无催化活性。从图中可以看出,当pH在5.5时,萝卜硫素的得率达到最大,酶解效果较佳。这与修丽丽在其研究中发现的甘蓝中葡萄糖硫苷酶的最适pH在5.5～6.5之间,是一致的[10]。当pH远离5.5,随着pH的增大或减小,萝卜硫素的得率逐渐减少。

2.1.2不同酶解时间对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响由图3可知,当酶解时间小于8 h,萝卜硫素的得率随着时间的增加快速上升;在8 h萝卜硫素的得率达到最大值,这主要由于8 h之前酶解时间不够,酶解效果随时间的增加变化较大。酶解时间超过8 h,萝卜硫素的得率有所降低,这主要受两方面的影响:一方面,少数萝卜硫素长时间接触空气所发生的自身降解或氧化而损失,另一方面,过度酶解造成其他的异硫氰酸酯类物质的产生,从而降低了萝卜硫素的得率[11]。因此,提取萝卜硫素的较佳酶解时间为8 h。

图3　酶解时间对萝卜硫素得率的影响Fig.3　Effect of hydrolysis time on yield of sulforaphane

2.1.3不同酶解温度对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响由图4可知,当酶解温度在15～35 ℃时,随着温度的升高,萝卜硫素的得率显著提高(p<0.05);在35 ℃时,萝卜硫素得率最高,说明萝卜硫苷的酶解效果最好;当酶解温度超过35 ℃时,随着温度的升高,其萝卜硫素的得率急速下降,获得萝卜硫素的含量明显减少。这说明胭脂萝卜中的酶活性与温度密切相关。不同种类的硫苷酶最适温度不同,Bo Pontoppidan等人研究发现在蓝蚜虫中分离纯化得到葡糖硫苷酶,最适温度为40 ℃[12]。这可能是由于两方面的因素所致:一方面偏离最适温度会使得酶的活性会降低,甚至没有酶解能力;另一方面,由于萝卜硫素在较高的温度下不稳定,容易分解也会造成萝卜硫素得率的降低。因此,较佳酶解温度为35 ℃。

根据采样定理,当采样率大于信号中最高频率的2倍时,采样之后的数字信号完整地保留了原始信号中的数据。本系统采样率为25 ksample/s,当电机转速为10 r/s时,频率为2 000 Hz,完全满足采样定理,所以该系统适用于该转速系统的数据采集。数据采集系统连接包络检波器采集读取天线端电压幅值,之后将获得的数据采用MATLAB仿真得到天线端电压幅值随时间变化曲线。

图4　酶解温度对萝卜硫素得率的影响Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on yield of sulforaphane

2.1.4不同VC添加量对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响胭脂萝卜中的内源性硫苷酶的活性受到很多因素的影响,比如:VC和Fe2+等金属离子可作为葡糖硫苷酶的激活剂[9]。不同VC添加量对胭脂萝卜废渣中萝卜硫素得率的影响,结果如图5。

由图5可知,当添加VC的含量小于0.2 mg/kg时,随着催化剂的添加,萝卜硫素的得率明显增加。主要是由于VC使得硫苷酶的酶活显著提高,在此过程中,硫苷酶的构象也发生了轻微的变化所致。当添加VC的添加量在大于0.2 mg/kg时,萝卜硫素的得率逐渐下降,这可能由于硫苷酶活性增强后,反应加快,可能催化生成了其他的异硫氰酸酯类物质,而降低萝卜硫素的含量。综上所述,较佳的VC添加量为0.2 mg/kg。

图5　VC添加量对萝卜硫素得率的影响Fig.5　Effect of VC content on yield of sulforaphane

2.2响应面优化结果与分析

2.2.1响应面实验结果与分析上述单因素实验已经确定pH、VC的添加量、酶解时间、酶解温度的取值范围,采用响应面实验的方法,以提取的萝卜硫素得率为参考指标,筛选出最佳的优化组合,结果见表2，方差分析结果见表3。

表2　响应面分析方案及实验结果Table 2　Program and test results of response surface analysis

表3　得率回归模型的方差分析Table 3　Variance analysis of regression equation on yield

注:**表示极显著,p<0.01;*表示显著,0.01

通过响应面曲面图的分析可知,最终求得二次多元方程为:Y=0.056+0.0002288A+0.00104B+0.00007634C-0.001377D+0.0008822AB+0.000389AC-0.0004103AD-0.0003223BC-0.001675BD+0.00112CD-0.002389A2-0.002506B2-0.002951C2-0.00269D2。

由表3方差分析结果可知,该回归方程(模型)的回归效果极显著(p<0.01),失拟项不显著,说明模型拟合程度好,有实际应用意义。各因素对得率影响的大小顺序分别为:D(酶解温度)>B(VC添加量)>A(pH)>C(酶解时间)。对响应值得率作用极显著的是D、A2、B2、C2和D2,显著的是B、BD、CD。由此可见,实验各因素对萝卜硫素得率的影响并非简单的线性关系。在p=0.05水平下剔除不显著项,对原模型进行优化可得,Y=0.056+0.00104B-0.001377D-0.001675BD+0.00112CD-0.002389A2-0.002506B2-0.002951C2-0.00269D2。

2.2.2交互作用对胭脂萝卜硫素得率的影响根据回归方程做出响应面分析图(结果见图6和图7),考察pH、VC添加量、酶解时间和酶解温度对萝卜硫素得率的影响。

图6　VC添加量与酶解温度对得率的影响Fig.6　Effect of VC content and hydrolysis temperature on yield

图7　酶解时间与酶解温度对得率的影响Fig.7　Effect of hydrolysis time and hydrolysis temperature on yield

两个因素的等高线越密集,形状越趋向椭圆,表明两个因素的交互作用越明显。由图6可知,酶解温度的变化坡度较VC添加量的坡度变化大,且酶解温度的等高线变化数量多于VC添加量,说明酶解温度对萝卜硫素得率的影响大于VC添加量的影响,且VC添加量和酶解温度有较强的交互作用;同理可知,在图7中酶解温度对得率的影响大于酶解时间的影响,且酶解时间和酶解温度有较强的交互作用。

2.2.3提取条件优化及验证经优化,提取萝卜硫素的最佳工艺参数为:pH5.64,VC添加量为0.24 mg/kg,酶解时间:7.71 h,酶解温度:31.02 ℃。为验证响应曲面法所得结果的可靠性,考虑到实际操作的便利,将工艺参数修正为:pH5.6,VC添加量为:0.24 mg/kg,酶解时间:7.7 h,酶解温度:31 ℃。在此条件下进行3次验证实验,测得的萝卜硫素的得率为0.05613%,与预测值0.0564823%接近,说明采用响应面法优化获得的提取条件可靠。

3　结论

采用Box-Behnken实验设计,以得率为响应值,优化pH、VC添加量和酶解温度、酶解时间四个因素,方差分析显示所建模型回归效果极显著,拟合度好。最佳的酶解条件为:酶解温度31 ℃,酶解时间7.7 h,pH为5.6,VC的添加量为0.24 mg/kg。在此条件下,萝卜硫素的得率为0.05613%。

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Optimization of enzymatic hydrolysis conditions for extracting sulforaphane from waste of carmine radish

YANG Hui,ZHAO Xue-qin,LI Chang-man,SUN Zhong-lei,LI Yu,LI Min,DENG Xin,HU Wei

(Department of Life Science & Tech,Yangtze Normal University,Chongqing 408100,China)

In this study,sulforaphane was extracted from the waste of carmine radish. In order to enhance the yield of sulforaphane,enzymatic hydrolysis conditions of glucosinolates in waste of carmine radish were optimized. Based on single-factor experiments,the effects of four factors(the hydrolysis temperature,hydrolysis time,amount of VC,pH value)on the yield of sulforaphane were investigated by response surface methodology. Experimental results showed that,when the hydrolysis temperature was 31 ℃,hydrolysis time was 7.7 h,amount of VCwas 0.24 mg/kg,pH was 5.6,the yield of sulforaphane was the highest with the value of 0.05613%,which were according with the predicted value of model. This indicated that extraction conditions which analyzed by response surface method were more reliable.

sulforaphane;enzymatic hydrolysis;waste of carmine radish;response surface methodology

2015-07-15

阳晖(1981-)，女，硕士研究生，讲师，研究方向：食品加工与分析检测，E-mail:yanghui-ren@sohu.com。

重庆市教委科学技术研究项目(KJ1401214)。

TS255.3

B

1002-0306(2016)05-0207-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.032