卢忠英,陈仕学,*,李彦青,姚元勇,鲁道旺,邢明明

(1.铜仁学院材料与化学工程学院实验中心,贵州铜仁 554300;2.铜仁学院应用化学研究所,贵州铜仁 554300)



响应面分析法优化缬草中黄酮类化合物的提取工艺

卢忠英1,陈仕学1,*,李彦青1,姚元勇2,鲁道旺2,邢明明2

(1.铜仁学院材料与化学工程学院实验中心,贵州铜仁 554300;2.铜仁学院应用化学研究所,贵州铜仁 554300)

本文以产自贵州地区的缬草为实验材料,以乙醇为浸提试剂,探究缬草中黄酮类化合物的提取工艺。方法:在乙醇浓度、料液比、浸提温度和浸提时间四个单因素实验基础上,采用响应面设计方法优化提取工艺参数。结果表明:最佳提取工艺为乙醇浓度53.0%,料液比1∶29 g/mL,浸提温度73 ℃,浸提时间2.6 h。在此条件下,实际得到的黄酮类化合物得率为2.133%,与理论提取率相比较,其RSD为3.5%。结论:响应面法优化的缬草中黄酮类化合物提取工艺稳定,具有可靠性。

缬草,黄酮类化合物,响应面分析法,得率

缬草(Valerianaofecnilis)为败酱科缬草属植物,主要以根茎入药。缬草主要有效成分有挥发油、环烯醚萜类、生物碱类、黄酮类化合物[1-4]。据报道,缬草中黄酮类化合物先已发现7种,其具有改善微循环、抗肿瘤和抗菌等生理活性[5]。基于缬草含丰富的有效成分,生物活性多样,具有广阔的开发前景,可以创造巨大的经济和社会效益[6-8]。黄酮类化合物是一类在植物体中广泛存在,且具有多种生物活性的多酚类化合物。它具有明显的抗溃疡、抗炎、抗菌、生物抗氧化性、降低血管脆性及异常的通透性、抑制血小板聚集和血栓形成等生理活性[9-11]。本文以缬草为原材料,以乙醇为提取剂进行浸提黄酮类化合物,在单因素实验基础上,采用响应面法优化实验得出最佳提取工艺条件,为缬草的进一步开发利用提供理论依据,从而提高缬草的综合利用价值。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

缬草采自贵州江口县;石油醚、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠成都金山化学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯。

电热恒温电水浴锅国华电器有限公司;DHG-9146型真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司;FW80型万能粉碎机北京科伟永兴仪器有限公司;AR124CN型电子天平上海恒平科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1标准曲线的绘制准确称取芦丁标准品10.0 mg,溶解,水浴加热,于100 mL容量瓶定容,制成0.1 mg/mL标准溶液。再用移液管移取芦丁标准溶液0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中,分别加入5 g/100 mL亚硝酸钠0.4 mL,放置5 min,再加10 g/100 mL硝酸铝0.4 mL,放置5 min,再加4 g/100 mL氢氧化钠4 mL。定容,静置10 min。在510 nm波长下测其吸光值,以芦丁标准样品质量浓度C mg/mL为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线。得出回归方程,由回归方程计算缬草中黄酮类化合物得率为:Y(%)=C×V×D×100/M。上式中:Y为得率,%;C为提取液中黄酮类化合物的含量,mg/mL;V为提取液的体积,mL;D为稀释倍数;M为样品质量g。

1.2.2工艺流程缬草→预处理→脱脂样品→乙醇提取黄酮→浓缩→黄酮类化合物的吸光值测定→数据整理优化提取条件→验证实验。

1.2.3材料预处理将缬草置于粉碎机内粉碎成粉末,将粉末通过100目筛子过滤后,用石油醚在回流装置里回流脱脂2 h,抽滤,置于烘干器中40 ℃干燥10 h,干燥后得样品备用。

1.2.4缬草中黄酮提取及含量测定准确称取脱脂样品干粉1.0 g置于容积100 mL 烧瓶内,按一定料液比加入乙醇水溶液在一定温度下回流提取一定时间后,过滤。相同方法提取两次,合并滤液,用乙醇水溶液定容。用回归方程测定缬草总黄酮得率。

1.2.5单因素实验设计和响应面实验方法称取5份预处理后的缬草粉末各1 g,设浸提料液比为1∶20 g/mL,浸提温度为70 ℃,浸提时间为2 h,考察乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%;对缬草中黄酮类化合物得率的影响,由此可得乙醇的最佳浓度。再以最佳乙醇浓度为浸提溶剂,继续考察料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL;浸提温度为55、60、65、70、75 ℃;浸提时间为1、1.5、2、2.5、3 h等因素对缬草中黄酮类化合物得率的影响。在上述实验基础上,为得到缬草中黄酮提取的最优工艺条件,以乙醇浓度(X1)、料液比(X2)、浸提温度(X3)、浸提时间(X4)为自变量设计实验,以黄酮类化合物得率(%)为响应值,进行响应面分析实验[12],实验因素和水平设计见表1。

1.3数据统计分析

单因素实验数据用Microsoft Office Excel2007分析作图。响应面优化实验数据采用Design-ExpertV8.0进行分析处理和作图。

2　结果与分析

2.1芦丁标准曲线的制作

由1.2.1的方法制得的标准曲线方程为:Y=0.084C-0.004(R2=0.999),二者呈良好的线性关系(见图1)。根据标准曲线计算黄酮类化合物的得率为:Y(%)=C×V×D×100/M。

表1　Box-Behnken设计实验因素水平及编码Table 1　The factors,levels and codes of Box-Behnken design

图1　标准曲线方程Fig.1　Standard cure of the rutin

2.2单因素实验

2.2.1乙醇浓度对缬草中黄酮类化合物得率的影响如图2所示。

图2　乙醇浓度对黄酮类化合物得率的影响Fig.2　The effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

由图2可知,当乙醇浓度在40%～50%之间时,得率明显增加,在50%达到最大,继续增加至60%时,得率一直降低。在60%～80%得率明显下降(p<0.05),乙醇浓度过大时会导致样品细胞内部杂质的溶出,而使黄酮类化合物得率略有增加。可见,当乙醇浓度为50%时得最高,确定最佳乙醇浓度为50%。

2.2.2料液比对缬草中黄酮类化合物得率的影响由图3可知,当料液比在1∶15～1∶30 g/mL时,得率持续增加;继续增加料液比至1∶35 g/mL,黄酮类化合物得率有显著下降趋势[13](p<0.05)。因此,确定最佳料液比为1∶30 g/mL。

2.2.3浸提温度对缬草中黄酮类化合物得率的影响如图4所示。

图3　料液比对黄酮类化合物得率的影响Fig.3　The effect of liquid ratio on the yield of flavonoids

图4　浸提温度对黄酮类化合物得率的影响Fig.4　The effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

由图4可知,当浸提温度在55～70 ℃时,缬草中黄酮的得率是缓缓增大的;浸提温度超过70 ℃时,黄酮类化合物得率有所下降,分析可能是温度过高破坏了黄酮类化合物的热稳定性,同时杂质溶出的概率也有所增加所致[14]。因此,确定最佳浸提温度可选为70 ℃。

2.2.4浸提时间对缬草中黄酮类化合物得率的影响如图5所示。

图5　浸提时间对黄酮类化合物得率的影响Fig.5　The effect of extraction time on the yield of flavonoids

由图5可知,当浸提温度在1～2.5 h之间时,黄酮类化合物得率稳步增长达到最大,继续增加时间,黄酮类化合物得率明显降低。因此,确定最佳浸提时间为2.5 h。

2.3响应面法优化提取缬草中黄酮类化合物

2.3.1响应面实验结果响应面实验结果见表2,方差分析见表3。

表2　响应面实验结果Table 2　The results of the response surface

表3　回归方程方差分析Table 3　Analysis of variance of the regression equation

表5　提取条件优化Table 5　Optimization of extraction condition

表4　回归方程可靠性分析Table 4　Credibility analysis of regression equation

2.3.2模型建立与方差分析利用Design-Expert.V8.0软件对表2响应值进行回归拟合,以X1、X2、X3、X4为自变量对得率Y进行数据拟合建立如下多元二次回归数学模型:

Y=2.11+0.014X1-9.167E-0.04X2+0.12X3+0.043X4-0.047X1X2+0.015X1X3+0.015X1X4-0.012X2X3-0.021X2X4-0.027X3X4-0.066X12-0.065X22-0.096X32-0.068X42

2.3.3响应面分析为考察各交互项对黄酮类化合物得率的影响,对该模型进行降维分析。由图6可直观观察各因素对响应值的影响,比较图(A)～图(F)可知,X3、X4随着量的增大,响应面值增大;当响应值增大到极值后,随着因素的增大,响应值逐渐减小;X1、X2影响响应面曲线较平缓,即影响黄酮类化合物得率的主次因素为X3>X4>X1>X2,与方差分析结果相同。

图6　乙醇浓度、料液比、浸提温度、浸提时间对黄酮类化合物得率交互影响响应面图Fig.6　Response surface plots showing the effects of four extraction conditions on flavonoids yield

2.3.4最佳提取工艺确定通过Design-Expert.V8.0对二元回归方程求最大值得到最佳提取工艺条件和黄酮类化合物理论最大得率。设计提取条件优化实验,在最优工艺条件下进行重复实验,计算得率,进行比较分析,实验结果见表5。

由表5可知,在最佳提取工艺条件下重复实验,黄酮得率为2.133%,接近理论得率2.143%,RSD值为3.5%,说明响应面法建立的黄酮类化合物提取数学模型具有稳定可靠性。

3　结论

本实验采用了Design-Expert.V8.0软件中的Box-Behnken(BBD)中心组合原理设计实验,选用乙醇作为溶剂提取缬草中的黄酮类化合物。结果表明:最佳提取工艺为乙醇浓度53.0%,料液比1∶29 g/mL,浸提温度73 ℃,浸提时间2.6 h。在此条件下,实际得到的黄酮类化合物得率为2.133%,与理论得率2.143%,其RSD为3.5%,充分说明了优化的缬草中黄酮类化合物提取为工艺稳定,具有可靠性。

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Extraction of flavonoids from valerian optimized by response surface method

LU Zhong-ying1,CHEN Shi-xue1,*,LI Yan-qing1,YAO Yuan-yong2,LU Dao-wang2,XING Ming-ming2

(1.Experimental Center of Materials and Chemical Engineering,Tongren University,Tongren 554300,China;2.Institute of Applied Chemistry,Tongren University,Tongren 554300,China)

The extraction process of flavonoid compounds originated from Valeriana ofecnilis(produced from Guizhou province)was investigated using ethanol as the extraction solvent. Method:Four factors,including concentration of Ethanol,ratio of raw material to solvent,extracting temperature and time,were optimized by response surface method. The optimum conditions were as follows:the concentration of ethanol was 53.0%;ratio of material to solvent was 1∶29 g/mL;extraction temperature was 73 ℃ and extraction time was 26 h. Under the optimum conditions,the difference of between real value of 2.133% and theoretic value in rate of extraction was about 3.5%. Conclusion:Response surface method was a reliable tool to optimize the extraction of flavonoid compounds fromValerianaofecnilis.

Valerianaofecnilis;Flavonoids;Response surface method;Yield

2015-06-25

卢忠英(1987-),女,硕士,讲师,研究方向:天然药物化学成分与新药研发,E-mail:luzhongying@126.com。

陈仕学(1976-),女,硕士，副教授,研究方向:主要从事生化分析与天然产物化学成分分离,E-mail:461330960@qq.com。

梵净山特色苗药资源保护与开发产学研基地(黔教合KY字[2014]233);贵州省教育厅自然科学研究项目(黔教合2013184);贵州省普通高等学校特色重点实验室(黔发合K字[2011]005)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)05-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.030