复合菌系的构建及其对玉米秸秆预处理的研究

2016-09-10魏如腾侯红萍白春艳

食品工业科技 2016年5期

关键词：里氏产酶假丝

魏如腾,侯红萍,白春艳

(山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷 030801)

复合菌系的构建及其对玉米秸秆预处理的研究

魏如腾,侯红萍*,白春艳

(山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷 030801)

黑曲霉,芽孢杆菌,里氏木霉,解脂假丝酵母,复合菌系,玉米秸秆

纤维素是地球上最丰富的多糖化合物,广泛存在于植物中,有资料表明,全世界每年生产纤维素及半纤维素的总量为850亿t。其中大部分农作物秸秆还是以焚烧的形式被处理掉,这不仅造成大量资源的浪费,还造成环境污染。近年来,随着人口增长、粮食短缺、石油危机等的出现,将纤维素水解为小分子单糖,单糖再通过微生物发酵生产各种有用的产品显得尤为重要。

秸秆预处理方法很多,其中物理、化学和生物预处理应用较广泛,原理都是借助外力改善秸秆的质地和结构。物理和化学预处理已有很多研究,但这两种方法会增加费用且易造成二次污染。生物预处理是在人工控制下,利用一些微生物的分解作用破坏秸秆的大分子物质,具有高效清洁的优点[1]。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

黑曲霉种子培养基、里氏木霉种子培养基、芽孢杆菌种子培养基、液体发酵产酶培养基配制方法参考文献[3]。

PHS-25C型数字酸度计上海人普仪器有限公司;TGL-16G高速台式离心机上海安亭科学仪器厂;HH-4数显恒温水浴锅金坛市科析仪器有限公司;722E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司;HP-500型电热恒温培养箱北京光明医疗仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1纤维素酶活力的测定以水解滤纸的酶活力代表纤维素酶的总活力(FPA酶活),以水解羧甲基纤维素的活力代表葡聚糖内切酶的活力(CMC酶活)[4]。

1.2.2葡萄糖标准曲线的制作用无水葡萄糖(分析纯,105 ℃下烘干至恒重)配制成1 mg/mL的葡萄糖标准溶液,分别取此标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于比色管中,补水至2.0 mL,加入2.0 mL DNS试剂,盖上盖,沸水浴5 min,立即冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀后,在550 nm处测定吸光值(OD值),每管重复测3次,结果取平均值。以吸光值为纵坐标,葡萄糖毫克数为横坐标绘制曲线图并建立回归方程,见图1所示。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1　Standard curve of glucose

1.2.3葡聚糖内切(CMC)酶活力的测定方法取25 mL比色管,加入适当稀释的上清酶液0.5 mL和1.0 mL浓度为1%的CMC-Na溶液,再加1.0 mL用pH4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制成1%(w/v)的羧甲基纤维素悬浮液,盖上盖子。在50 ℃、振幅80的条件下水浴30 min。取出后迅速加入2.0 mL DNS溶液,之后沸水浴5 min,水浴后立刻取出用流动水冷却并定容至25 mL,混匀,在550 nm处测OD值。

1.2.4滤纸(FPA)酶活力的测定方法取25 mL比色管,以1 cm×6 cm(50±1) mg的新华滤纸条为底物,加入适当稀释的上清酶液0.5 mL和pH4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,盖上盖子。在50 ℃、振幅80的条件下水浴30 min。取出后迅速加入2.0 mL DNS溶液,之后沸水浴5 min,水浴后立刻取出用流动水冷却并定容至25 mL,混匀,在550 nm处测OD值。

1.2.5酶活定义在一定的温度及pH条件下,1 min从底物溶液中分解产生1 μg还原糖所需要的酶量即为一个酶活单位,简称为U[5]。

1.3各菌株的产纤维素酶情况

1.3.1芽孢杆菌T7.0产酶情况将芽孢杆菌T7.0按6%接种量接种于装有50 mL产酶培养基的250 mL三角瓶中,33 ℃、140 r/min发酵5 d,分别测定其CMC酶活和FPA酶活[2]。

1.3.3里氏木霉产纤维素酶情况将里氏木霉按10%接种量接种于装有50 mL产酶培养基的250 mL三角瓶中,30 ℃、140 r/min发酵5 d,分别测定其CMC酶活和FPA酶活[2]。

1.4三株菌复合发酵产纤维素酶情况

1.5复合菌不同接种方式对酶活的影响

不同酶组分分泌的纤维素酶类型不同,酶活也不尽相同,故复合菌系可提高降解纤维素效率[7]。在接种总量一定的条件下,通过改变复合菌的接种方式,改变不同酶组分的产量,从整体上提高纤维素的降解能力。另外,某一菌种所分泌的代谢产物也有可能成为其它菌种生长所需的营养成分,从而加快菌种生长并分泌纤维素酶[7]。

1.6复合菌对不同秸秆降解效果的研究

将复合菌按9%接种量(芽孢杆菌T7.0∶黑曲霉Z34∶里氏木霉=2∶1∶2)接入装有100 mL混合产酶培养基的250 mL三角瓶中,分别以玉米秸秆、小麦秸秆、黄豆秸秆(均过40目),于31 ℃、140 r/min条件下发酵5 d,测其CMC酶活力。

表2　复合菌之间的接种比例Table 2　The proportion of Inoculation among the compound bacteria

1.7解脂假丝酵母对玉米秸秆进行生物预处理效果的研究

1.7.1玉米秸秆预处理时间对降解效果的影响将解脂假丝酵母的种子培养液按2%接种量接入玉米秸秆产酶培养基,分别处理0、12、24、36、48、60 h以后接入复合菌,于31 ℃、140 r/min下发酵5 d,测其CMC酶活。

表1　复合菌的接种顺序Table 1　Inoculation sequence of compound bacteria

1.7.2解脂假丝酵母接种量对降解效果的影响将解脂假丝酵母的种子培养液分别按1%、2%、3%、4%、5%接种量接入玉米秸秆产酶培养基,处理36 h后接入复合菌,于31 ℃、140 r/min下发酵5 d,测其CMC酶活。

1.7.3玉米秸秆粉碎度对降解效果的影响将解脂假丝酵母的种子培养液按2%接种量接入不同粉碎度的玉米秸秆(10、20、30、40、50、60、70目)产酶培养基中,处理36 h后接入复合菌,于31 ℃、140 r/min下发酵5 d,测其CMC酶活。

1.8正交实验

在单因素实验的基础上,采用Minitab16软件设计正交试验，根据三因素三水平试验对解脂假丝酵母和复合菌共同发酵产纤维素酶进行优化。因素水平表见3。

表3　正交实验因素水平Table 3　Factors and levels of the orthogonal test

2　结果与分析

2.1各菌株的产纤维素酶情况

2.1.1芽孢杆菌T7.0产酶情况从图2可以看出芽孢杆菌T7.0在第1 d时,FPA酶活比CMC酶活高,第2 d CMC酶活力和FPA酶活力开始升高,当第3 d时CMC和FPA酶活力活力均达到最高,分别为128.06、121.75 U/mL,从第4 d开始两种酶活开始下降,可能是营养物质消耗,代谢产物积累,导致活力下降。

图2　芽孢杆菌T7.0产纤维素酶的情况Fig.2　The enzyme production of Bacillus T7.0

图3　黑曲霉产纤维素酶的情况Fig.3　The enzyme production of aspergillus niger

2.1.3里氏木霉产纤维素酶情况从图4可以看出第1 d菌体生长旺盛,在第2 d时活力达到最高,CMC酶活力和FPA酶活力分别为157.61、174.86 U/mL,从第3 d开始,由于营养物质缺乏、菌体老化、产物抑制等原因造成酶活力下降。

由上述结果可知,若将不同菌种进行混合培养,优势互补,有利于完善纤维素酶组分、提高酶活、缩短产酶周期、提高纤维素降解效率[8]。

表4　复合菌的接种顺序对CMC酶活的影响Table 4　Effects of inoculation sequence of compound bacteria on CMC enzyme activity

表5　复合菌的接种比例对酶活的影响Table 5　Effects of the proportion of the compound bacteria on the activity of the enzyme

图4　里氏木霉产纤维素酶情况Fig.4　The enzyme production of Trichoderma reesei

2.2三株菌复合发酵产纤维素酶情况

图5　复合菌产酶活力测定Fig.5　Determination of the activity of the compound bacteria producing enzyme

2.3复合菌不同接种方式对酶活的影响

2.3.2复合菌的接种比例对酶活的影响由表5可知,接种比例不一样,其CMC酶活存在差异,实验7(黑曲霉Z34∶里氏木霉∶芽孢杆菌T7.0=2∶1∶2)的酶活最高,达到365.98 U/mL,比实验1高出12.99%。

2.4复合菌对不同秸秆降解效果的研究

从图6可以看出复合菌对玉米秸秆的降解效果明显高于小麦秸秆与黄豆秸秆,达到388.18 U/mL。后续实验进一步研究了复合菌对玉米秸秆的降解效果。

图6　复合菌对不同秸秆降解效果的影响Fig.6　Effect of compound bacteria on the degradation of different straw

2.5解脂假丝酵母对玉米秸秆进行生物预处理效果的研究

2.5.1玉米秸秆预处理时间对降解效果的影响由图7可知,随着处理时间的延长,CMC酶活力逐渐增大,当达到36 h时活力达到最高点,并且酶活力基本趋于稳定。

图7　玉米秸秆预处理时间对降解效果的影响Fig.7　Effect of pretreatment time on degradation of corn stalk

2.5.2解脂假丝酵母接种量对降解效果的影响从图8可知,当解脂假丝酵母接种量为2%时,CMC酶活力最高,接种量小,在规定的培养时间内,有限的解脂假丝酵母种子液不足以萌发足够的菌体,菌体生长缓慢,产酶活力低;而接种量大,导致菌体过多,培养基中的营养物质主要用于菌体自身的生长繁殖,产酶活力也较低。

表7　正交实验方差分析Table 7　Variance analysis of the orthogonal test

图8　解脂假丝酵母接种量对降解效率的影响Fig.8　Effect of inoculation amount on degradation efficiency of Candida lipolytica

2.5.3玉米秸秆粉碎度对降解效果的影响从图9可以看出,随着秸秆粉碎度的越来越大,CMC酶活力也逐渐变大。当秸秆粉碎度为30目时,相比10目时提高了8.04%,粉碎度为40目时,相比10目时提高了8.96%,而秸秆粉碎度40目相比30目只提高了0.85%,考虑到生产应用,减少成本以及机械损耗[9],选择玉米秸秆粉碎度为30目。

图9　玉米秸秆粉碎度对降解效果的影响Fig.9　Effects of corn stalk crushing degree on the degradation effect

2.6正交实验结果与分析

从表6可以看出各因素对CMC酶活的影响大小依次为接种量>时间>粉碎度。最佳组合是A2B2C3,即:时间36 h、接种量2%、粉碎度40目。

根据表6可以确定,理论上的最优组合是A2B2C3,这个组合与5号实验得到的最优组合A2B2C3相同,因此,可以确定最优组合是A2B2C3,即时间36 h、接种量2%、粉碎度40目,此时酶活力为408.55 U/mL,但是考虑到大规模生产的生产成本以及机械损耗,组合A2B2C2(酶活力为404.28U/mL),即时间36 h、接种量2%、粉碎度30目,带来的效益要比组合A2B2C3大,所以选择组合A2B2C2,即时间36h、接种量2%、粉碎度30目。

从表7可知,各因素对酶活的影响大小依次是:接种量、时间、粉碎度,其中时间、接种量对酶活影响极显著,粉碎度影响不显著。