孟丹阳,赵　伟,*,杨瑞金,让一峰

(1.江南大学食品学院,江苏无锡 214122;2.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡 214122)



小麦面筋蛋白酶解过程中功能性质的变化规律研究

孟丹阳1,赵伟1,*,杨瑞金2,让一峰1

(1.江南大学食品学院,江苏无锡 214122;2.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡 214122)

本文对小麦面筋蛋白在连续酶解过程中水解度(DH)、有效谷氨酰胺含量以及黏度、氮溶解指数(NSI)、起泡性、乳化性等功能性质的变化规律进行了研究。结果表明,在酶底比相同的情况下,与中性蛋白酶、风味蛋白酶相比,碱性蛋白酶对小麦蛋白的酶解效率最高,同一反应时间的DH最大,反应至360 min时,DH达到16.96%。随着DH的增加:有效谷氨酰胺含量小幅度降低,在水解度小于15.13%的范围内,其提取率大于86.2%;黏度减小,在DH 10.93%时出现短暂的上升;NSI、起泡能力指数、泡沫稳定指数、乳化活力指数、乳化稳定指数在DH 2.21%～15.13%范围内皆为先提高后降低,峰值分别为61.8%、225%、56.67%、10.57 m2/g、49.08,分别出现在DH 10.39%、8.81%、8.81%、9.64%、8.81%处,均在DH 8.8%～10.5%范围内。

小麦面筋蛋白,酶解,功能性质

小麦面筋蛋白(wheat gluten)又称谷朊粉、活性小麦面筋,粉末状,由小麦面粉中的蛋白质进行分离、提取、再烘干制成。Beccari在1728年最早发现[1]、并于1745年从小麦面粉生面团中洗出谷朊粉。中国的谷朊粉生产起步晚,但是发展速度很快,产量已经远远超过国内的需求[2]。因此对谷朊粉进行有效利用,提高其附加值具有重要的社会和经济意义。

谷朊粉的蛋白质含量在75%～82%,氨基酸组成比较齐全,是食品加工中的重要原料,但其含疏水性氨基酸较多,离解度低,很难溶于水,因而影响其应用[3],对其改性可改善其功能性质,拓宽应用领域。酶法改性是一种较为温和可控的改性方法,指利用碱性蛋白酶,中性蛋白酶,胰蛋白酶等水解酶类,专一或非专一性切断肽键或者酰胺键,减小蛋白的分子量,改变空间结构,变成多肽或者小分子氨基酸,从而提高其溶解性[4]。然而深度水解往往会损坏其乳化性、发泡性等功能性质[5],因此经过有限酶解小麦蛋白提高其在水中的分散性即可拓展它的用途。齐军茹[6]等人采用控制酶解提高了谷朊粉的功能特性。孔祥珍[7]等人用木瓜蛋白酶去酰胺改性谷朊粉,研究谷朊蛋白功能性质的变化。

在小麦面筋蛋白的加工利用中,所需产品的功能性质因用途而异,因此准确把握蛋白的水解程度,高效地生产出目标产品具有至关重要的意义。本文研究了小麦面筋蛋白在不同酶的作用下的水解进程,并以水解度为自变量,深层次揭示了小麦面筋蛋白在酶解过程中的功能性质变化规律,以期更好地指导实际生产和应用。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

小麦面筋蛋白联海生物科技有限公司;碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶诺维信酶制剂有限公司;福林酚试剂Sigma公司;L-2,4-二氨基丁酸(DABA,纯度99.8%)上海翰鸿试剂有限公司;2,4-二硝基氟苯(DNFB)中国上海Sigma分公司;双(1,1-三氟乙酸基)碘苯(BTI)美国Aldrich公司,大豆油金龙鱼有限公司。

MP-501A超级恒温循环槽上海一恒科学仪器有限公司;DK-824电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司;C-MAG HS 4 S25磁力搅拌器上海圣科仪器设备有限公司;FE20实验室pH计梅特勒托利多仪器(上海)有限公司;高速分散器T25德国IKA;BS2202 S和BS 224 S精密天平赛多利斯科学仪器有限公司;KDN-103F自动定氮仪上海纤检仪器有限公司;UV-1100型紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司;Agilent 1100高效液相色谱仪安捷伦科技有限公司;NDJ-5S数显旋转粘度计上海羽通仪器仪表厂。

1.2实验方法

1.2.1基本成分测定粗蛋白含量测定:微量凯氏定氮法(GB 5009.5-2010),蛋白质换算系数为5.70;含水量测定:105 ℃恒重法(GB 5009.3-2010);灰分含量测定:灼烧法(GB 5009.4-2010)粗脂肪含量测定:索氏抽提法(GB/T 5512-2008)。

1.2.2氨基酸组成测定参照GB/T 5009.124-2003。

1.2.3蛋白酶活力测定福林法(GB/T 23527-2009)。

1.2.4小麦面筋蛋白的酶解将小麦面筋蛋白分散于已预热至最适温度的去离子水中,形成固形物浓度10%的悬浮液,加氢氧化钠溶液调至最适pH并保持,加酶(150 U/g小麦面筋蛋白)后恒温搅拌,反应结束采用100 ℃、10 min水浴灭酶,迅速冷却并喷雾干燥。

1.2.5水解度的测定pH-Stat法。蛋白质水解度指蛋白质在水解反应过程中被水解的肽键的百分数,参照Adler-Nissen[8]的方法,加酶之前用1 mol/L的NaOH调节反应体系到蛋白酶最适pH,反应过程中用浓度为0.1 mol/L的NaOH调节pH并使其保持恒定,分别每5 min(反应时间0～30 min)、每15 min(反应时间30～90 min)、每30 min(反应时间90～360 min)记录反应过程中所使用的碱液量。水解度计算公式:

其中,B-所消耗的0.1mol/LNaOH的体积;mL;Nb-碱液的浓度,0.1mol/L;α-α-NH2的平均解离度;mp-底物中蛋白质质量,g;htot-底物蛋白总肽键,对小麦面筋蛋白,htot=8.38[4]。

1.2.6有效谷氨酰胺含量测定将非氮端谷氨酰胺定义为有效谷氨酰胺。样品中的非氮端谷氨酰胺经BTI衍生转化为DABA,再经紫外显色后用超高效液相色谱仪检测定量,具体操作步骤见参考文献[9-10]。

1.2.7粘度的测定从酶解罐里取出适量样品,立即用旋转粘度计测定溶液的粘度,每组样品重复测定3次,取平均值。

1.2.8氮溶解指数(NSI)的测定将样品溶于去离子水中,配制成1%(w/v)的溶液,搅拌1h,离心20min(4000r/min),取上清液,用微量凯氏定氮法(GB5009.5-2010)测上清液蛋白质含量。NSI(%)=上清液中蛋白质含量/样品中总蛋白质含量×100。

1.2.9起泡性、泡沫稳定性的测定参照文献[11]的方法,将蛋白溶于去离子水中,配制成1%(w/v)的溶液,取30mL用高速分散器10000r/min搅打1min后立即倒入量筒,记下泡沫体积V1,10min后记录下泡沫体积V2。起泡能力指数=V1/30,泡沫稳定指数=V2/V1。

1.2.10乳化性、乳化稳定性的测定参考Pearce和Kinsella的方法[12],略做修改。将谷朊粉水解物溶于去离子水,配制成1%(w/v)的溶液,取35mL加入5mL大豆油,10000r/min搅拌1min,立即吸取底部样液,以0.1%SDS(w/v)稀释100倍,测定500nm处的吸光值A,以0.1%SDS(w/v)为空白,10min后再次取样、稀释、测吸光度。乳化性以乳化活力指数(EAI)表示:EAI=2×(2.303A)×N×10-4/φLC

其中:EAI-每克蛋白质的乳化面积(m2/g);N-稀释倍数;φ-油相占体系分数,为0.125;C-蛋白质浓度(g/mL);L-比色池光径(1cm)。

乳化稳定性用乳化稳定指数(ESI,单位为1)表示:ES=A0×ΔT/(A0-At)

其中:A0-0 时刻的吸光值;At-t时刻的吸光值。

2　结果与讨论

2.1原料小麦面筋蛋白理化、功能性质分析

2.1.1主要成分由表1可知,小麦面筋蛋白中蛋白质含量丰富,灰分和脂肪含量很少,富含非氮端谷氨酰胺。

2.1.2氨基酸组成由表2可知,小麦面筋蛋白氨基酸组成比较齐全,必需氨基酸含量为20.2%,有较高的营养价值;酸水解后的谷氨酸含量为29.20%,其中23.41%是以非氮端谷氨酰胺的形式存在于原料中(表1);脯氨酸为疏水氨基酸,含量高达9.78%,而赖氨酸、精氨酸、组氨酸等亲水氨基酸含量较少。氨基酸组成直接影响小麦蛋白的溶解性、起泡性等功能性质。

表1　小麦面筋蛋白主要成分(g/100 g)Table 1　Main composition of wheat gluten(g/100 g)

表2　小麦面筋蛋白氨基酸组成Table 2　Amino acid composition of wheat gluten

注:*为必需氨基酸;表中未显示的氨基酸代表未检测出。

2.1.3功能性质分析由表3可知,谷朊粉的各功能性质有限,改性以改善其功能性质有重要意义。

表3　小麦面筋蛋白主要功能性质Table 3　Main functionalities of wheat gluten

2.2不同蛋白酶酶解的水解度进程曲线

根据初步酶解实验,各种酶最适温度、pH条件如表4所示。分别采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶(150 U/g)在最适温度、pH下对谷朊粉进行酶解。由图1可知,随着反应时间的延长,三种酶解反应DH不断增大并趋于平缓,水解速率降低。水解速率降低的原因有[13]:随着酶解的进行,反应体系中底物蛋白质中用于水解的肽键浓度降低;酶解过程中产生的酶解产物对蛋白的酶解过程产生了抑制作用;二级酶自动失活,以及可溶性产物的增多使水分活度降低,导致蛋白酶的活力下降[14]。在酶底比相同的情况下,同一反应时间的DH碱性蛋白酶>中性蛋白酶>风味蛋白酶,反应至360 min时,a的水解度达到16.96%,b达到5.28%,c达到2.05%。3种酶相比,在相同的反应时间内碱性蛋白酶能达到的DH最高,因此选择碱性蛋白酶酶解作为后续研究的基础。

图1　小麦蛋白酶解进程曲线Fig.1　Enzymatic hydrolysis of wheat gluten with different proteases

2.3酶解过程中有效谷氨酰胺含量的变化规律

谷氨酰胺是机体在应激状态下的一种“条件必需氨基酸”,但游离谷氨酰胺或氮端谷氨酰胺在溶液中极易发生环化生成焦谷氨酸[15],失去本有的功效,因此将非氮端谷氨酰胺定义为有效谷氨酰胺。谷氨酰胺肽作为谷氨酰胺的稳态化供体,可从小麦面筋蛋白酶解物中获取。1993年,日本学者Tanabe等[16]首次以小麦面筋蛋白为原料,采用Molsin(XIII)和Actinase E两种蛋白酶对底物进行48 h酶解,再经Sephadex G-15纯化后得到高谷氨酰胺含量的小麦低聚肽。吕艳[17]采用酸性蛋白酶在小麦面筋蛋白[S]=15 g/100 mL、[E]/[S]=5%、pH2.5、温度45 ℃条件下酶解3 h,制得谷氨酰胺肽中有效谷氨酰胺含量为11.2%。

表4　各种酶最适反应温度和pHTable 4　The optimal reaction temperature and pH of enzymes

图2　有效谷氨酰胺含量随DH的变化曲线Fig.2　The change curve of effective glutamine content with DH

由图2可知,随着水解度由0增长到15.13%,样品中有效谷氨酰胺含量由23.41%降至20.18%,有效谷氨酰胺最终提取率86.2%。碱性蛋白酶是内切酶,反应过程中可能会水解酰胺基团,但本研究中,小麦面筋蛋白中的有效谷氨酰胺在碱性蛋白酶酶解过程中破坏程度较小,符合高含量谷氨酰胺肽的要求。

2.4酶解过程中粘度的变化规律

如图3所示,随着水解度的增加,样品粘度由9.8 mPa·s快速下降至4.3 mPa·s,而后又以相对缓慢的速度降至2.7 mPa·s,在DH10.39%～11.71%范围内时,粘度又略有上升,至3 mPa·s,随后继续缓慢下降。这可能与小麦面筋蛋白酶解时蛋白质分子的变化有关。

图3　粘度随DH的变化曲线Fig.3　The change curve of viscosity with DH

小麦面筋蛋白主要成分为麦谷蛋白和麦醇溶蛋白。前者是由分子内和分子间二硫键形成的大的多聚体;后者是单体分子,二硫键都分布于分子内部,分子为非极性,呈球形。两者之间通过化学键强烈缠绕而成为复杂的高分子聚合物。经过适当酶解后,小麦蛋白质大分子肽链断裂形成多肽和小分子短链物质,二硫键部分断裂,释放谷蛋白亚基,网络结构受到一些破坏,分子粒径减小,粘度下降。而后粘度略有上升可能是由类蛋白反应造成的。Danilevski和Okuneff于1902年在蛋白水解液中添加凝乳酶导致沉淀产生发现而发现类蛋白反应,其原理就是由较低的分子质量的肽在反应过程中受到水解作用、缩合作用、转肽作用以及物理聚集作用的影响,而最终形成类似与蛋白质的混合物体[18],通常被认为是蛋白质水解反应的逆反应。不同水解度的谷朊粉,分子间的相互作用不同,且本研究中固形物浓度较小(10%),不足以保持类蛋白反应长期占优势,因此粘度略升高以后继续下降,并趋于平稳。

2.5酶解过程中NSI的变化规律

溶解度的影响主要因素为疏水性、电荷率,氨基酸分析表明:小麦蛋白中含有大量的谷氨酰胺(Gln)和脯氨酸(Pro)及非极性氨基酸,带电氨基酸含量较少,因此难溶于水。小麦蛋白经过蛋白酶水解后,分子内氢键部分断裂,分子量减小,蛋白质分子构象展开,更多的氨基酸残基暴露,使得蛋白与溶剂之间的作用力增大从而溶解性得以提高。如图4所示,随着水解度的增大,蛋白逐渐被酶水解为更小的分子,溶解性逐渐提高,同样在DH10.39%达到峰值61.8%后,开始缓慢下降。这可能跟粘度略上升的原因相同,即类蛋白反应产生了一些不溶物。

图4　NSI随DH的变化曲线Fig.4　The change curve of NSI with DH

2.6酶解过程中泡沫性能的变化规律

由图5可知,随着水解度的增大,样品起泡能力指数逐渐由74%增大至峰值225%,而后逐渐减小;泡沫稳定指数由59.46%迅速下降后上升至峰值56.67%,而后逐渐降低。酶解打破了谷朊粉大分子原有的网络结构,所以酶解初期泡沫稳定性迅速下降,随着水解度继续增大,肽键断裂的数量增多,蛋白质分子柔性增加,变得更舒展,更多的基团暴露在水中,且界面张力降低,形成稳定界面相的能力增强,因此起泡能力指数和泡沫稳定指数增大。蛋白质的分子量减小到一定程度后,成为了多肽或者氨基酸,失去了蛋白质固有的空间结构,不足以稳定液膜,使起泡能力指数和泡沫稳定指数又有所下降。

图5　泡沫性能随DH的变化曲线Fig.5　The change curve of foaming properties with DH

2.7酶解过程中乳化性能的变化规律

图6　乳化性能随DH的变化曲线Fig.6　The change curve of emulsifying properties with DH

蛋白质表面性质使蛋白质具有一定的乳化性。如图6所示,随着水解度的增大,蛋白分子量减小,分子空间结构打开,蛋白分子柔性增加,溶解性增加,使蛋白质分子很快扩散到界面膜上,增大了蛋白质的乳化性。从图中可以看出水解度9.64%时乳化活力指数最大,为10.57 m2/g,当水解度为8.81%时,乳化稳定指数达到最大值49.08。而后水解度继续增加,蛋白质被水解为分子量更小的短肽或者游离氨基酸,双亲结构改变,使乳化活力指数和乳化稳定指数都降低。由此看出适度的酶水解可以提高溶解度,从而提高乳化性[19]。

3　结论

在酶解小麦面筋蛋白的研究中发现,随着反应时间的延长,水解度持续增大并最终趋于平稳,在酶底比相同的情况下,碱性蛋白酶能达到更高的水解度。本文通过碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白研究了其功能性质随水解度的变化规律,结果表明随着水解度的增大,有效谷氨酰胺含量缓慢减少,但在水解度15.13%以下时能保持较高的提取率(大于86.2%);粘度下降并在DH10.39%时略回升,之后略有下降并趋于平稳;NSI、起泡能力指数、泡沫稳定指数、乳化活力指数、乳化稳定指数皆为先提高后降低,且峰值均在DH8.8%～10.5%范围内。由此可见在此水解度范围内小麦面筋蛋白各方面功能性质改善效果良好,在实际应用中不同产品的所需功能性质不同,可根据侧重点的不同来进行适度酶解,以求高效地生产目标产品。

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Study on the change rules of functionalities in enzymatic hydrolysis of wheat gluten

MENG Dan-yang1,ZHAO Wei1,*,YANG Rui-jin2,RANG Yi-feng1

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.State Key Laboratory of Food Science & Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Change rules of degree of hydrolysis(DH),effective glutamine and functionalities such as viscosity,nitrogen solubility index(NSI),emulsification,foaming capacity in enzymatic hydrolysis of wheat gluten were investigated.The results showed that alcalase posed the highest enzymatic hydrolysis efficiency,which got the highest DH at any time in the process of enzymatic hydrolysis compared with neutral protease and flavorzyme in the case of the same enzyme substrate ratio,while DH reached 16.96% at the reaction time of 360 min.With the increase of DH,effective glutamine content decreased slightly,of which the retention remained at 86.2% or more with DH range of 0～15.13%.Viscosity kept decreasing in general while temporarily increased slightly at DH 10.93%.NSI,foaming ability,foam stabilizing index,emulsifying activity,emulsifying stability index all increased in the DH range of 2.21%～15.13% at first,reaching a maximum of 61.8%,225%,56.67%,10.57 m2/g,49.08 at DH10.39%,8.81%,8.81%,9.64%,8.81% respectively,which were in the DH range of 8.8%～10.5% and then dropped down.

wheat gluten;enzymatic hydrolysis;functionalities

2015-08-31

孟丹阳(1993-)，女，硕士研究生，研究方向：食品加工与配料，E-mail：danyangmeng@163.com。

赵伟(1982-)，男，博士，教授，研究方向：食品加工，E-mail：zhaow@jiangnan.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31271977)。

TS201

A

1002-0306(2016)05-0115-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.014