高士刚， 曾 蓉， 徐丽慧， 罗金燕， 陈 磊， 戴富明

（1上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海 201403；2上海市设施园艺重点实验室，上海 201403；3上海市农业技术推广服务中心，上海 201103）

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

高士刚1，2， 曾 蓉1，2， 徐丽慧1，2， 罗金燕3， 陈 磊3， 戴富明1，2

（1上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海 201403；2上海市设施园艺重点实验室，上海 201403；3上海市农业技术推广服务中心，上海 201103）

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌（Corynespora cassiicola）、黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）和黄瓜细菌性角斑病菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S rDNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物；通过鉴定引物的特异性，筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物；选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR，对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化，优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物，其中引物CC4F/CC4R 和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS，引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS，引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp，其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离，这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中，当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16 μmol·L-1时，3个目的片段能同时得到有效扩增；当退火温度大于65℃时，部分目的片段不能有效扩增。……